Фагоцитарное звено иммунитета методы

Об аллергии
Технология ImmunoCAP®
Диагностика астмы
Пищевая аллергия
Ингаляционная аллергия
Аллергия на насекомых
Лекарственная аллергия
Перекрестные аллергены
Аллергия у детей
Методики аллергодиагностики
Анализы на аллергию
Анализы на аллергию ЦЕНЫ
Прайс лист другие виды диагностики

——————-

О лаборатории, контакты
Общая информация
Для специалистов: методики в аллергологии
- Обзор современных методов диагностики аллергии in vitro
- Анализ методом ИммуноСАР в лаборатории ФидесЛаб
- Углубленный анализ непереносимости в лаборатории ФидесЛаб
- Инструкция на метод РВМ
- Лекарственная непереносимость
- Объем иммунограммы
- Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов
- Панели аллергенов
- Спектр аллергенов (расширенный)
- Методика определения общего IgE
- Методика определения специфических IgG при аллергии
- Определение наиболее частых аллергенов
- Анализ крови на самые частые аллергены
Как проехать

——————-

Оценка фагоцитарного звена системы иммунитета является неотъемлемым элементом оценки иммунного статуса, который нарушается при многих воспалительно-инфекционных заболеваниях. Для оценки фагоцитарного звена системы иммунитета используют исследование количества и функциональной активности нейтрофилов (реже моноцитов) крови.

Определяют:

процент и общее число, морфологию нейтрофилов крови
поглотительную активность нейтрофилов по поглощению частиц латекса, стафилококков, кандид
- вычисляют фагоцитарное число (среднее число поглощенных частиц)
- подсчитывают фагоцитарный индекс (процент нейтрофилов участвующих в фагоцитозе)
метаболическую активность нейтрофилов по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) в формазан
хемотаксическую подвижность – по оценке подвижности к хемотаксическому веществу
адгезивную активность – по прилипанию к поверхностям, а также выявляют молекулы адгезии с помощью моноклональных антител
оценивают фенотип нейтрофилов – рецепторы и CD-антигены
определяют переваривающую активность (фагоцитарный киллинг).

Важнейшими среди этих показателей являются поглотительная и переваривающая активность нейтрофилов, так как они прямо отражают их противоинфекционные возможности. При использовании для оценки переваривающей активности нейтрофилов бактерий трудно исследовать эту функцию. Основным методом оценки переваривания бактерий нейтрофилами является разрушение лейкоцитов, посев на питательную среду и подсчёт выросших колоний бактерий. Другой метод – оценка путём проточной цитометрии меченых бактерий или кандид. Хотя последний метод достаточно точен, но требует дорогостоящей аппаратуры, недоступной большинству лабораторий.

R. Lehrer и M. Cline заметили, что живые клетки Candida albicans не окрашиваются метиленовым синим, в то время как мёртвые клетки окрашиваются этим красителем. Это наблюдение позволило решить проблему учёта количественной характеристики киллинга дрожжевых клеток фагоцитами. В последующем J.S. Solomkin с соавторами разработали метод, позволяющий оценивать кинетику фагоцитоза, который не претерпел практически никаких изменений до наших дней, за исключением вариаций объёкта фагоцитоз, когда в качестве объекта используют, например, Saccharomices cerevisiae.

Нами разработан метод оценки активности фагоцитарного звена иммунитета, а именно, поглотительной и переваривающей активности нейтрофилов.

Показания к применению

Все виды иммунопатологии. Первичные и вторичные иммунодефицитные болезни, аллергические и аутоиммунные заболевания.

Иммунологический мониторинг населения, проживающего в экологически неблагоприятных регионах.

Контроль за иммунотерапией заболеваний, состоянием иммунитета после противоопухолевой химио и лучевой терапии.

Разработка и проведение доклинических и клинических испытаний иммуномодуляторов.

Перечень необходимого оборудования:

Центрифуга (1000 об /мин).
Камера Горяева или Солар.
Стеклянные центрифужные пробирки 10 мл (100 шт.).
Термостат.
Автоматические дозаторы 20 – 200 мкл.
Микроскоп с иммерсионным увеличением.
Предметные стёкла (50 шт.)

Реактивы.

Физиологический раствор хлорида натрия на фосфатном буфере (ФСБ) рН 7,2 или раствор Хенкса.
Культура Candida albicans. Метиленовый синий. Азур. Эозин

Описание технологии использования метода

Подготовка Candida albicans

Готовят рабочую взвесь отмытых кандид (5.107 клеток в 1 мл). Оценивают жизнеспособность кандид и используют только суспензию содержащую не менее 96% живых Candida albicans. Для этого смешивают 0,05 мл суспензии кандид и 0,1 мл краски (смесь равных объемов 0,2% раствора водного эозина и 0,1% метиленового синего на дистиллированной воде), через 10 минут взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут на центрифуге ОПН-3, надосадочную жидкость отсасывают, а из осадка делают мазок, высушивают и подсчитывают при световой микроскопии 200 кандид. Оценивают процент живых, имеющих легкое розовое окрашивание и неживых, окрашенных синькой, дрожжевых клеток.

Подготовка суспензии лейкоцитов больного

Утром, натощак, берут 5-10 мл крови из вены в пробирку с гепарином (20 ед. на 1 мл крови). Кровь отстаивают в пробирке в течение 1 часа, до момента четкого отделения эритроцитов от лейкоцитов. Кончик пипетки опускают близко к осевшим эритроцитам и вращательным движением пипетки поднимают осевшие эритроциты, до окрашивания плазмы в легкий красный цвет (смесь эритроцитов с лейкоцитами предотвращает агрегацию лейкоцитов и облегчает подсчет показателей фагоцитоза) и забирают по 0,1 мл такой плазмы на каждую пробу. Количество фагоцитов в методе не стандартизируется, а берется их реальное содержание в плазме через 1 час отстаивания.

Оценка поглотительной активности нейтрофилов

Оценивают фагоцитарный индекс (ФИ), фагоцитарное число (ФЧ) и киллинг в % убитых клеток через 30 и 60 минут инкубации. Все пробы дублируют. В каждую пробирку вносят 0,1 мл плазмы исследуемого пациента и добавляют 0,05 мл рабочей взвеси кандид. Пробы инкубируют в термостате 30 и 60 минут при 37С. Затем взвесь клеток центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин, отсасывают 0,05 мл надосадочной жидкости, осадок аккуратно ресуспензируют и наносят 0,05 мл в виде капли на край предметного стекла. Затем отполированным краем второго предметного стекла размазывают каплю по стеклу, делая тонкий мазок, высушивают, фиксируют спиртом и окрашивают азур-эозином (по Романовскому) в течение 5-10 минут.

Вычисляют фагоцитарный индекс Гамбургера, для этого при световой микроскопии, под иммерсией подсчитывают процент фагоцитов имеющих поглощённые кандиды.

Находят фагоцитарное число Райта (среднее число фагоцитированных кандид на один фагоцит): подсчитывают количество кандид в этих фагоцитах и делят на количество этих фагоцитов. При исследовании этих показателей оценивают 200 нейтрофилов.

Оценка киллинга кандид нейтрофилами

К 0,05 мл взвеси клеток оставшихся в пробирке добавляют 0,2 мл дистиллированной воды для лизиса клеток крови. Затем, добавляют 0,5 мл краски (смесь равных объемов 0,2% раствора водного эозина и 0,1% метиленового синего на дистиллированной воде) для окрашивания убитых фагоцитами кандид на 10 мин. Далее взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут, надосадочную жидкость отсасывают, а из осадка делают мазок, высушивают и подсчитывают при световой микроскопии процент убитых фагоцитами, окрашенных синькой, дрожжевых клеток. Живые кандиды имеют лёгкое розоватое окрашивание. Оценивают 200 кандид.

Результаты

Исследование двух показателей фагоцитарного звена системы иммунитета у 30 здоровых людей (доноров) показало, что после 30 минутной инкубации фагоцитарный индекс составил 74,6+-10,3%; фагоцитарное число — 2,7+-0,35; киллинг — 26,3+-4,1%.

В соответствии с этим в норме показатели фагоцитарного звена системы иммунитета с использованием Candida albicans следующие:

фагоцитарный индекс 65-85% (74,6+-10,3%)
фагоцитарное число 2,5-3,0 (2,7+-0,35)
киллинг 22-30% (26,3+-4,1).

Исследование этих показателей в динамике позволяет оценить скорость лизиса поглощённых клеток. Повышение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа при сохранённом киллинге указывает на дефицит переваривания дрожжевых клеток. Уменьшение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа через 30 минут указывает на дефицит поглощения. Уменьшение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа может наблюдаться через 60 мину при интенсивном лизисе дрожжевых клеток.

Примечателен факт высокой точности предлагаемого нами метода оценки показателей фагоцитарного звена системы иммунитета. При сравнении результатов полученных нашим методом (фагоцитарный индекс нейтрофилов цельной крови после 30 минутной инкубации 74,6+-10,3%) и результатов с использованием проточного цитофлюориметра (фагоцитарный индекс нейтрофилов цельной крови доноров после 30 минутной инкубации 75+-10%) [4] отмечено абсолютное сходство.

Контакты:

О лаборатории

Общая информация
Основные методики
Образцы бланков-заказов исследований
Образцы результатов анализов
Определение наиболее частых аллергенов

Полезная информация

Тестирование с помощью скрининговых смесей (ImmunoCAP®)
Перекрёстные аллергены
Изменение проявлений аллергии с возрастом
Аллергические риниты

на главную

Источник

Лабораторная оценка нарушений врожденного иммунитета

Функциональная оценка В-лимфоцитов

Определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях является одним из наиболее важных интегральных показателей функциональной полноценности В-лимфоцитов и всей системы регуляции гуморального адаптивного иммунитета.

Традиционно концентрацию сывороточных иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини.В настоящее время этот метод все еще находит свое применение, предпочтение отдается моноклональным антителам против отдельных антигенных детерминант (эпитопов), характерных для отдельных классов иммуноглобулинов.

Принцип метода Манчинизаключается в том, что образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агара, в которых содержатся антитела против IgM, IgG, IgA в стандартной концентрации. Иммуноглобулины, содержащиеся в исследуемой сыворотке, диффундируют в агар и при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитации. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Окончательный размер кольца преципитации зависит от концентрации соответствующих иммуноглобулинов. Метод Манчини позволяет определить концентрацию иммуноглобулинов, равную 10 мкг/мл. Ошибка метода составляет 10%.

Для диагностики нарушений врожденного иммунитета обычно определяют фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и оценивают состояние системы комплемента.

Наиболее информативными для оценки фагоцитарной системы следует считать фагоцитарный индекс, фагоцитарное число (отражает поглотительную способность нейтрофилов) и индекс бактерицидности (отражает переваривающую способность нейтрофила).

Фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.

Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число бактерий или частиц латекса, поглощенных в расчете на один нейтрофил.

Также проводятсятесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение).

При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 370 С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов, поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия –НСТ-тест позволяет оценить метаболическую активность гранулоцитов крови, выявляет резервные возможности внутриклеточных систем фагоцитов. НСТ-тест основан на восстановлении поглощенного лейкоцитами крови растворимого красителя – нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан черного цвета (внутриядерные включения – глыбки диформазана) под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции, инициирующей процесс стимуляции фагоцитоза.

Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия).

В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий E. coli или раствор пирогенала (липополисахарид S. typhi ) в разведении 1:10. На другое обезжиренное стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 минут. Готовят мазки, высушивают, фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая процент лейкоцитов с гранулами восстановленного НСТ (диформазан черного цвета).

Источник

Для оценки фагоцитарной системы чаще всего используется определение: — —

*фагоцитарного индекса нейтрофилов и моноцитов;

* бактерицидности нейтрофилов и моноцитов;

*образования активных форм кислорода и азота;

* хемотаксиса;

* экспрессии на лейкоцитах молекул адгезии.

Поэтому именно на нейтрофилах оценивают поглотительную и метаболическую функциональную активность фагоцитов крови, ставя два нижеприведённых теста: НСТ-тест и тест фагоцитоза с латексом. Тесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза проводятся с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение). При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 37° С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов; поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия — HCT’mecm основан на восстановлении лейкоцитами крови с помощью активных форм кислорода нитросинего тетразолияв диформазан. При этом используется способность ферментов, опосредующих Киллинг бактерий в фагоцитах, изменять окраску нитросинего тетразолия от изначально желтой до сине-фиолетовой (внутркядерные включения — глыбки диформазана). Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия). В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий Е.соli или раствор пирогенала в разведении 1:IO. На другое обезжирешое стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофилной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 мин. готовят мазки, высушивают,фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая % лейкоцитов с гарнулами восттановленного НСТ(диформазан синего цвета)

Неспецифическая клеточная защита организма осуществляется лейкоцитами, которые способны к фагоцитозу. Фагоцитоз — это процесс узнавания, захвата и поглощения разных чужеродных структур (разрушенных клеток, бактерий, комплексов антиген-антитело и др.). Клетки, осуществляющие фагоцитоз (нейтрофилы, моноциты, макрофаги), называются общим термином — фагоциты. Фагоциты активно передвигаются и содержат большое количество гранул с различными биологически активными веществами.

Фгоцитарную активность лейкоцитов

Метод

Из крови определенным способом получают лейкоцитарную взвесь, которую смешивают с точным количеством лейкоцитов (1млрд микробов в 1 мл). Через 30 и 120 мин готовят мазки из этой смеси и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом просматривают около 200 клеток и определяют количество фагоцитов, которые поглотили бактерии, интенсивность их захвата и уничтожения.
1. Фагоцитарный индекс — это процент фагоцитов, поглотивших бактерии через 30 и 120 мин, к общему количеству просмотренных клеток.
2. Фагоцитарный показатель — среднее число бактерий, находящихся в фагоците через 30 и 120 мин (производят математическое деление общего числа поглощенных фагоцитами бактерий на фагоцитарный индекс)
3. Индекс завершенности фагоцитоза — рассчитывается делением числа убитых бактерий в фагоцитах на общее число поглощенных бактерий и умножением на 100

БИЛЕТ

1 Классификация гиперчувствительности по джеллу и кумбсу

Изучение молекулярных механизмов аллергии привело к созданию Джейлом и Кумбсом в 1968 г. новой классификации. В соответствии с ней различают четыре основных типа аллергии: анафилактический (I тип), цитотоксический (II тип), иммунокомплексный (III тип) и опосредованный клетками (IV тип). Первые три типа относятся к ГНТ, четвертый — к ГЗТ. Ведущая роль в запуске ГНТ играют антитела (IgE, G и М), а ГЗТ — лимфоидно-макрофагальная реакция.

Аллергическая реакция I типа связана с биологическими эффектами IgE и G4, названных реагинами, которые обладают цитофильностью — сродством к тучным клеткам и базофилам. Эти клетки несут на поверхности высокоаффинный FcR, связывающий IgE и G4 и использующий их как ко-рецепторный фактор специфического взаимодействия с эпитопом аллергена. Связывание аллергена с рецепторным комплексом вызывает дегрануляцию базофила и тучной клетки — залповый выброс биологически активных соединений (гистамин, гепарин и др.), содержащихся в гранулах, в межклеточное пространство. В результате развиваются бронхоспазм, вазодилатация, отек и прочие симптомы, характерные для анафилаксии. Вырабатываемые цитокины стимулируют клеточное звено иммунитета: образование Т2-хелпера и эозинофилогенез.

Цитотоксические антитела (IgG, IgM), направленные против поверхностных структур (антигенов) соматических клеток макроорганизма, связываются с клеточными мембранами клеток-мишеней и запускают различные механизмы антителозависимой цитотоксичности (аллергическая реакция II типа). Массивный цитолиз сопровождается соответствующими клиническими проявлениями. Классическим примером является гемолитическая болезнь в результате резус-конфликта или переливания иногруппной крови.

Цитотоксическим действием обладают также комплексы антиген-антитело, образующиеся в организме пациента в большом количестве после введения массивной дозы антигена (аллергическая реакция III типа). В связи с кумулятивным эффектом клиническая симптоматика аллергической реакции III типа имеет отсроченную манифестацию, иногда на срок более 7 суток.

Лабораторная диагностика аллергии при аллергических реакциях I типа основана на выявлении суммарных и специфических реагинов (IgE, IgG4) в сыворотке крови пациента. При аллергических реакциях II типа в сыворотке крови определяют цитотоксические антитела (антиэритроцитарные, антилейкоцитарные, антитромбоцитарные и др.). При аллергических реакциях III типа в сыворотке крови выявляют иммунные комплексы. Для обнаружения аллергических реакций IV типа применяют кожно-аллергические пробы, которые широко используют в диагностике некоторых инфекционных и паразитарных заболеваний и микозов (туберкулез, лепра, бруцеллез, туляремия и др.).

Дата добавления: 2016-11-18; просмотров: 2478 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов