Иммунитет у беспозвоночных животных
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ
И НАУКИ УКРАИНЫ
ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ В.Н. КАРАЗИНА
КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
КУРСОВАЯ
РАБОТА ПО ИММУНОЛОГИИ
Защитные
системы беспозвоночных
животных
Выполнил:
студент
биологического факультета
группы
Б-134
Беликов
Юрий Юрьевич
Руководитель:
доцент
Мартыненко Вера Владимировна
Харьков
2010
оглавление
Изучение
разнообразных видов позвоночных позволяет
составить представление об эволюционном
развитии иммунной системы вплоть до формирования
её сложноорганизованных механизмов у
млекопитающих. Однако филогенез системы
приобретённого иммунитета позвоночных,
особенно его молекулярных основ, остается
неясным, несмотря на многочисленные исследования
иммунитета у беспозвоночных. В то же время
изучение беспозвоночных проливает свет
на происхождение врождённого иммунитета,
полностью сформированного уже у позвоночных.
Поскольку беспозвоночные чрезвычайно
многочисленны и разнообразны — одиночные
и колониальные формы, полостные и бесполостные,
обладающие и не обладающие кровеносной
системой — среди них можно найти много
удобных объектов для экспериментальных
исследований.
Упрощённое
представление эволюционного древа царства
животных учитывает разделение от вторичнополостных
на две основные ветви, принципиально
различающиеся по стадиям эмбриогенеза.
Одна ветвь, ведущая к первичноротым —
моллюскам, кольчатым червям и членистоногим
— дивергировала на этом раннем этапе эволюции
от пути, ведущего к появлению вторичноротых
— иглокожих, оболочников и позвоночных.
Исследования в области иммунитета у беспозвоночных
проводятся в основном на членистоногих
и моллюсках, в связи с тем, что многие
из них являются переносчиками возбудителей
болезней или вредителями сельскохозяйственных
культур. Поэтому филогенетически более
близкие к позвоночным таксоны привлекают
гораздо меньше внимания. Кроме того, поскольку
все предки позвоночных — вымершие виды,
выводы о происхождении иммунитета у позвоночных,
сделанные на основании изучения беспозвоночных,
могут быть лишь гипотетическими, основанными
на предположении о близком родстве некоторых
современных животных с предковыми позвоночными.
У
большинства беспозвоночных имеются белые
клетки, но красные клетки, как правило,
отсутствуют. Лейкоциты могут либо быть
зафиксированными, либо свободно мигрировать
по кровеносным сосудам, либо заселять
заполненные жидкостью полости тела, называемые
целомом или гемицеломом. Первые клетки
крови образовались, вероятно, из свободноживущих
предковых клеток, сходных с простейшими.
У примитивных многоклеточных, например,
у губок, кишечнополостных и плоских червей,
блуждающие фагоцитарные амебоциты не
только выполняют функцию защиты, но и
участвуют в процессах питания и экскреции.
На
уровне вторичнополостных, тела которых
крупнее и более сложно устроены, возникла
необходимость в циркуляторной системе
для переноса питательных веществ и отходов
внутри организма. Амебоподобные клетки,
больше не нужные для собирания пищи, вероятно,
мигрировали из соединительной ткани
в эту циркуляторную систему. Здесь из
них образовалось множество типов клеток,
часть которых приобрела специфическую
роль в иммунореактивности.
Из-за
огромного разнообразия беспозвоночных
их свободные лейкоциты невозможно классифицировать
только по окрашиваемости и морфологии,
в отличие от лейкоцитов позвоночных.
Однако по функциональным критериям удается
выделить пять основных групп таких клеток.
•
Клетки-предшественники, которые
наряду с имеющейся в том или ином количестве
гемопоэтической тканью могут играть
роль стволовых клеток. По строению они
напоминают лимфоциты позвоночных, но
данных о действительной гомологии очень
мало.
•
Фагоцитарные клетки, которые, вероятно,
представляют собой единственный тип
клеток, присутствующий у всех представителей
царства животных. Они соответствуют гранулоцитам
или макрофагам млекопитающих, но несут
иные поверхностные маркеры.
•
Гемостатические клетки, которые
принимают участие в коагуляции и заживлении
ран и важны как эффекторы для распознавания
«не-своего».
•
Питающие клетки присутствуют лишь
у некоторых видов.
•
Пигментные клетки имеются у многих
видов, но только у некоторых они содержат
дыхательный пигмент, напоминая тем самым
эритроциты позвоночных.
Беспозвоночные
лишены лимфоцитов и антител, но, тем не
менее, обладают эффективными механизмами
защиты. Иммунные системы беспозвоночных,
очевидно, не включают в качестве компонентов
ни иммуноглобулинов, ни взаимодействующих
субпопуляций лимфоцитов, ни лимфоидных
органов. Тем не менее, само существование
огромного числа и разнообразия беспозвоночных
свидетельствует о наличии у них эффективных
систем защиты собственного организма.
Как
и у позвоночных, первой линией обороны
у них служат эффективные физико-химические
барьеры. Слизь, покрывающая тело многих
кишечнополостных, кольчатых червей, моллюсков
и некоторых оболочников, задерживает
и уничтожает потенциально патогенные
микроорганизмы. Твёрдый наружный скелет,
такой как панцирь или скорлупа, у некоторых
кишечнополостных, моллюсков, иглокожих
и насекомых также препятствует инвазии
в организм чужеродного материала. При
нарушении целостности этих барьеров
против проникшего в организм чужеродного
тела действует целый ряд взаимосвязанных
клеточных и гуморальных защитных механизмов,
к которым относятся следующие:
•
Свёртывание/коагуляция крови и заживление
ран.
•
Фагоцитоз.
•
Инкапсулирование.
Эти
механизмы предполагают распознавание
«не-своего» и присутствие рецепторных
молекул в крови и на поверхности клеток
крови.
1)
Коагуляция и заживление. Раны быстро
закрываются благодаря коагуляции жидкостей
организма, вызываемой гемостатическими
клетками и компонентами плазмы. Раны,
образующиеся у беспозвоночных при травме
или инвазии паразитов, быстро заживают,
что предотвращает смертельную потерю
жидкостей организма. Раны закрываются
вследствие выпячивания жирового тела
или кишки, сокращения мышц, коагуляции
плазмы, миграции клеток крови к месту
поражения и их агрегации с образованием
тромба и/или за счет отложения меланина.
Миграцию лейкоцитов к ране стимулируют,
вероятно, цитокин-подобные факторы. Тромбирование
раны с коагуляцией плазмы наблюдается
главным образом у членистоногих, хотя
получены данные об аналогичном процессе
у кольчатых червей и иглокожих. В коагуляции
участвуют гемостатические клетки, которые
агрегируют в месте повреждения и выделяют
своё содержимое, вызывающее свёртывание
плазмы и образование прочной гемоцитарной
«пробки». У многих видов в этом процессе
участвуют и компоненты плазмы. Как и у
млекопитающих, сама повреждённая ткань,
микробные компоненты, а также изменения
концентрации Са2+ или рН индуцируют
сложный каскад ферментативных реакций
в месте повреждения. Это напоминает альтернативный
путь активации комплемента. Система настолько
чувствительна, что у мечехвостов, например,
она активируется эндотоксином Escherichia
coli в дозе всего 4 нг/мл. Процесс коагуляции
чрезвычайно важен, поскольку обеспечивает
высокочувствительное распознавание
«чужого» благодаря дегрануляции гемостатических
клеток. В коагуляции может принимать
участие фермент профенолоксидаза: превращаясь
под действием каскада сериновых протеаз
в фенолоксидазу, она способствует образованию
медиаторов более поздних стадий иммунного
ответа. Недавно установлено, что каскад
ПФО существует и у других беспозвоночных,
таких, как круглые черви и оболочники.
2) Фагоцитоз
и инкапсулирование. Внедрившихся
микробов поглощают фагоцитарные клетки,
более крупные агенты окружаются многоклеточными
капсулами. Иммунологические исследования
были начаты в самом начале XX в. На основе
данных исследований Мечникова было объявлено,
что амебоидные клетки у почти всех примитивных
беспозвоночных принимают участие в процессах
внутриклеточного пищеварения, которые
сохранились у наиболее высокоразвитых
животных в виде внутренней системы обороны.
На самом деле, фагоциты широко распространены
у беспозвоночных, и эксперименты по внедрению
живым организмам чужеродного материала
показали их способность удалять разные
чуждые организму частицы.
Фагоциты обязаны
в одно и тоже время «избегать»
обычные ткани собственного организма
и съедать чужеродные частицы. По-видимому,
они принимают участие и в удалении «собственной»
ткани, испорченной вследствие наличия
ксенобиотика, к примеру, загрязнителя.
Табл.1.
Типы беспозвоночных,
имеющих активную
реакцию амебоцитов.
О механизме
данного процесса известно мало. Распознавание
случается при контакте фагоцита с его
мишенью. Данные о существовании у беспозвоночных
настолько же развитой, как у позвоночных,
системы антител, служащих переходным
звеном при распознавании антигенов, отсутствуют,
хотя есть ссылки на опсониновую активность
жидкостей их тела.
Предполагаемые
механизмы распознавания клеток
фагоцитами представлены на рис. 1. Прямое
узнавание (рис.1, А), по всей видимости,
осуществляется фагоцитами, «патрулирующими»
ткани беспозвоночных с массивным туловищем,
вместе с тем у животных с переполненными
жидкостями полостями важную роль в обеспечении
фагоцитоза играют опсонины.
Рис.
1. Модели фагоцитарных
иммунных систем беспозвоночных.
Фагоцитарные клетки
присутствуют у всех беспозвоночных и
вместе с врождёнными гуморальными факторами
образуют первую линию защиты от микроорганизмов.
Как и у позвоночных,
здесь наблюдаются все фазы их действия:
хемотаксис, прикрепление, поглощение
и уничтожение. Однако распознавание мишени
опосредуют не Fc-рецепторы, и лишь у одного
вида на поверхности фагоцитов обнаружены
СЗ-подобные рецепторы. Фагоцитоз, как
и у позвоночных, может происходить без
участия опсонизирующих факторов. Однако
у моллюсков, членистоногих и оболочников
в присутствии лектинов плазмы и компонентов
профенолоксидазного каскада он усиливается.
Некоторые патогены, однако, научились
использовать защитные лектины животных
ради собственной выгоды. Например, многие
вирусы проникают в клетку, прицепившись
к молекулам лектинов, расположенным на
поверхности клетки. Поэтому выработка
защитных лектинов животными может быть
«палкой о двух концах».
Лектины растений,
введенные в организм животного,
могут оказывать действие, сходное
с действием собственных лектинов животного.
Например, они могут влиять на работу различных
компонентов иммунной системы. Они могут
даже стимулировать гибель (апоптоз) раковых
клеток. Один из лектинов омелы (Viscum album)
широко применяется в медицине для лечения
рака. Лектины, взаимодействующие с
поверхностными углеводами патогена,
представляют собой некий универсальных
механизм, позволяющий воздействовать
на рост микроорганизмов. Этот механизм
используется как растениями, так и животными.
Если
внедрившиеся патогенные микробы слишком
крупны или многочисленны, вокруг них
образуются многоклеточные агрегаты,
называемые узелками или капсулами и напоминающие
гранулёмы у млекопитающих. Секвестрированные
таким образом микроорганизмы предположительно
погибают под действием лизосомных ферментов
и лизоцима, содержащихся в лейкоцитах,
а также под действием пероксидазы и активных
форм кислорода.
И
фагоцитоз, и инкапсулирование зависят
от кооперации гемостатических и фагоцитарных
клеток.
Жидкости организма
содержат у беспозвоночных ряд врождённых
и индуцибельных гуморальных защитных
факторов.
Врождённые
защитные факторы. У беспозвоночных
не обнаружено иммуноглобулинов, но жидкости
организма содержат ряд защитных гуморальных
факторов — агглютинины, лизоцим и другие
лизины, иные антимикробные соединения,
лизосомные ферменты и обездвиживающие
факторы. Имеются также данные, указывающие
на присутствие компонентов комплемент-подобной
системы. Например, у морских ежей на фагоцитах
могут присутствовать СЗ-подобные рецепторы,
и обнаружена гуморальная литическая
система, сходная с системой комплемента.
Кроме того, установлено, что кровь гусениц
реагирует с одним из факторов яда кобры
и при этом появляется СЗ-конвертазная
активность. Обладающий ею фермент расщепляет
молекулы СЗ быка с образованием молекул,
подобных СЗ. Профенолоксидазный каскад
у членистоногих сравним с альтернативным
путем активации системы комплемента,
поскольку оба они стимулируются непосредственно
компонентами микробных клеток и включают
ряд последовательно активируемых протеаз.
Для того чтобы подтвердить наличие у
беспозвоночных альтернативных путей
активации комплемента, необходимы детальные
исследования на молекулярном уровне.
Индуцибельные
гуморальные защитные факторы.
Известно,
что у беспозвоночных содержание агглютининов
и гемолизинов иногда возрастает, однако
подробно индуцибельные антимикробные
факторы исследованы только у насекомых.
Способность в течение жизни вырабатывать иммунитет к новым инфекциям у позвоночных животных обеспечивается прижизненной перестройкой генов защитных белков — иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов. Оказалось, что у насекомых тонкая подгонка набора защитных белков к конкретной инфекции тоже осуществляется путем перекомбинирования фрагментов генов, однако редактированию подвергаются не сами гены (молекулы ДНК), как в лимфоцитах позвоночных, а их копии — молекулы РНК.
Основная обязанность иммунной системы — безошибочно распознавать любую попавшую в организм заразу, в том числе и такую, с какой раньше никогда не приходилось встречаться. Для этого нужно иметь очень много разных белков, избирательно связывающихся с различными чужеродными веществами (антигенами). Позвоночные животные продуцируют сотни тысяч вариантов таких защитных белков (в том числе так называемых антител) — гораздо больше, чем генов в геноме. Высокое разнообразие защитных белков достигается благодаря прижизненным перестройкам генома в клетках иммунной системы — лимфоцитах.
В геноме «зародышевой линии», то есть в том геноме, который позвоночное животное получает от папы с мамой, нет генов антител как таковых, а есть наборы заготовок — несколько «кассет» похожих, но немного различающихся фрагментов будущего гена. В зреющем лимфоците специальные ферменты режут и перекраивают геномную ДНК, чтобы собрать из этих заготовок один функциональный ген, причем из каждой «кассеты», состоящей из десятков похожих фрагментов, случайным образом выбирается какой-то один. В разных лимфоцитах гены антител получаются разными, а общее число теоретически возможных вариантов у человека или мыши достигает трех миллионов. Подробнее об этом можно прочесть здесь. Приобретенный иммунитет формируется за счет того, что те лимфоциты, чьи антитела лучше других связываются с данным инфекционным агентом, усиленно размножаются, а гены их антител вдобавок еще и «подгоняются» к антигену за счет мутирования и дополнительного отбора.
Всего этого нет у беспозвоночных. Долгое время считалось, что беспозвоночным удается как-то обходиться одним лишь врожденным, неспецифическим иммунитетом и сравнительно небольшим числом иммунных белков — рецепторов, гены которых в «явном виде» присутствуют в геноме зародышевой линии и не подвергаются прижизненным перестройкам. Учитывая быструю эволюцию и вариабельность микроорганизмов, было довольно удивительно, каким образом беспозвоночные ухитряются при этом выжить.
Однако со временем открывалось всё больше фактов, показывающих, что у беспозвоночных тоже формируется приобретенный иммунитет и есть иммунная память. Вот только как им это удается без прижизненных перестроек генов иммунной защиты, оставалось неясным.
Иммунологи из Университета Джонса Гопкинса (Балтимор, США) обратили внимание на один весьма необычный ген, имеющийся и у позвоночных, и у насекомых. Этот ген называется DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule); определенные его мутации у человека ассоциированы с синдромом Дауна. У насекомых он, как было известно, отвечает за регуляцию роста аксонов (длинных отростков нейронов). Ген этот принадлежит к надсемейству иммуноглобулинов, то есть содержит иммуноглобулиновые домены (определенные последовательности нуклеотидов, кодирующие участки белковой молекулы, предназначенные для избирательного связывания других молекул). Иммуноглобулиновые гены есть практически у всех животных. Они выполняют разнообразные рецепторные функции, далеко не всегда связанные с иммунной защитой. Например, рост аксонов направляется определенными химическими сигналами, которые тоже кто-то должен улавливать и распознавать.
Как и почти все гены высших организмов, ген DSCAM состоит из экзонов (кодирующих участков) и вставленных между ними некодирующих интронов. После того, как на матрице гена синтезируется его РНК-копия, интроны из нее вырезаются (этот процесс называется сплайсингом), и уже эта «зрелая матричная РНК» используется как инструкция для синтеза белка. Из одной и той же незрелой РНК иногда может быть сконструировано несколько вариантов зрелой РНК (например, за счет перекомбинирования или выборочного удаления отдельных экзонов). Это явление называется «альтернативным сплайсингом». Благодаря ему один и тот же ген может кодировать несколько разных белков.
Уникальной особенностью гена DSCAM, содержащего 21 экзон, является то, что три из них представлены не в единственном экземпляре, а в виде целых кассет из множества немного различающихся копий: экзон №4 представлен в 14 экземплярах, экзон №6 — в 30, экзон №10 — в 38. В ходе сплайсинга сохраняется только один вариант каждого из этих экзонов. Таким образом, за счет альтернативного сплайсинга на основе единственного гена DSCAM может быть синтезировано 14 × 30 × 38 = 15960 разных рецепторных белков.
Мысль об участии гена DSCAM у насекомых не только в нейрогенезе, но и в иммунной защите, по правде сказать, напрашивалась давно, но доказать это удалось только сейчас. Ученые выбрали в качестве объекта исследования малярийного комара Anopheles gambiae (его геном был недавно полностью прочтен), а также культуру «гемоцитоподобных иммунокомпетентных клеток» (то есть клеток иммунной системы) этого комара. Результаты, полученные на целых живых комарах и в культуре клеток почти полностью совпали.
Оказалось, что в присутствии разных бактерий иммунные клетки производят разные наборы сплайс-вариантов белка DSCAM. Например, в ответ на заражение кишечной палочкой резко увеличивается частота использования 8-го варианта 4-го экзона, тогда как стафилококк стимулирует синтез белков DSCAM с использованием 1-го варианта того же экзона.
Искусственное «выключение» гена DSCAM приводит к резкому снижению способности комара сопротивляться инфекциям; кроме того, в его гемолимфе (аналог крови у насекомых) начинают бурно размножаться бактерии, в норме присутствующие там в небольших количествах. Это доказывает непосредственное участие DSCAM в иммунной защите.
Молекулярные биологи сегодня умеют «отключать» не только весь ген целиком, но и выборочно отдельные сплайс-варианты. Для этого в клетки вводят искусственно синтезированные короткие молекулы РНК с последовательностью нуклеотидов, комплементарной определенному экзону. Эти фрагменты слипаются со зрелыми РНК, содержащими данный экзон, что препятствует синтезу белка. Таким образом было показано, что отключение тех сплайс-вариантов, которые синтезируются в присутствии кишечной палочки, лишает комара способности бороться именно с кишечной палочкой, но не со стафилококком, и наоборот.
Ученым также удалось показать, что сплайс-варианты DSCAM, синтезируемые в ответ на заражение той или иной бактерией, лучше других «прилипают» именно к этой бактерии.
Изменения в спектре синтезируемых сплайс-вариантов DSCAM, спровоцированные контактом с бактериями, сохраняются в течение как минимум 18 часов после того, как контакт прекратился (что происходит потом, ученые просто не проверяли). Это отчасти объясняет наблюдаемую у насекомых «иммунную память».
Таким образом, различные сплайс-варианты белка DSCAM до некоторой степени аналогичны антителам позвоночных (хотя антитела значительно более избирательны и эффективны). Образование разнообразных сплайс-вариантов DSCAM осуществляется на основе того же комбинаторного принципа, что и образование антител у позвоночных. В обоих случаях используется случайный выбор и комбинирование отдельных фрагментов гена, каждый из которых представлен в геноме в виде нескольких альтернативных вариантов. Только у позвоночных это «перекраивание» генетической информации осуществляется на уровне ДНК, а у насекомых — на уровне РНК.
Данное исследование, на мой взгляд, представляет собой очень крупный прорыв не только в изучении иммунной системы беспозвоночных, но и в понимании общих принципов иммунитета в целом. Можно ожидать, что дальнейшие исследования приведут к открытию новых черт сходства между иммунными системами далеких друг от друга групп организмов.
За рамками исследования осталось множество важных вопросов. Например, осталось неясным, каким образом осуществляется регуляция сплайсинга. Откуда комар «знает», какие варианты белка DSCAM нужно синтезировать для борьбы с кишечной палочкой, а какие — для защиты от стафилококка? Теоретически здесь возможны два варианта:
1) Регуляция без использования обратной связи (какие-то рецепторы распознают класс антигена и дают сигнал синтезировать такой-то набор сплайс-вариантов; в этом случае все ответы известны заранее, они напрямую «записаны» где-то в геноме и являются полностью врожденными);
2) Регуляция методом проб и ошибок с использованием обратной связи (синтезируются разные варианты белка, которые затем тестируются на эффективность связывания с антигеном; синтез «удачных» вариантов продолжается, «неудачных» — прекращается; в этом случае можно говорить о настоящем приобретенном иммунитете).
Авторы статьи размышляют только над первым вариантом, но второй — более похожий на то, что происходит у позвоночных, и гораздо более гибкий и эффективный — тоже пока не исключен.
Источник: Yuemei Dong, Harry E. Taylor, George Dimopoulos. AgDscam, a Hypervariable Immunoglobulin Domain-Containing Receptor of the Anopheles gambiae Innate Immune System // PLoS Biology. 2006. V. 4. Issue 7.
См. также:
Гонококки обманывают иммунную систему, внося контролируемые изменения в свой геном («Элементы», 31.05.2006).
Александр Марков