К методам оценки гуморального иммунитета относится
1. Методы первого уровня основаны на доказательстве взаимодействия в системе антиген-антитело. Положительные результаты свидетельствуют о специфичности реакций. В принципе можно выделить три типа реакций:
— тест конъюгации. При этом маркируют один из реагентов, результаты оценивают по его связыванию с другими реагентами на основании физических или химических свойств конъюгата (прямая иммунофлюоресценция, иммунопероксидазный метод, ауторадиография);
— тесты, основанные на изменении свойств одного из реагентов (например, изменение флюоресценции, электрического потенциала, вязкости раствора; синтез соединений с более высокой молекулярной массой, изменение ферментативной активности антигенов). Эти тесты обладают ограниченными возможностями;
— тесты, основанные на отделении комплекса антиген-антитело от несвязанных реагентов с помощью техники высаливания, преципитации, использования специфических антител или адгезии на клеточной поверхности. К ним следует отнести большинство радио- и иммуноферментных методов.
2. Методы второго уровня основаны на более сложном характере взаимодействия между антигеном (поливалентным) антителом (по меньшей мере двухвалентными антителами). При этом механизмы преципитации, агглютинации и т. д., лежащие в основе комплекса, в большей степени, чем при методах первого уровня, зависят от рН, ионной силы и других условий реакции. Поэтому положительные результаты не всегда определяют степень выраженности реакции антиген-антитело, а отрицательные еще не означают отсутствия этой реакции. Тем не менее, среди методов этой группы можно отметить и такие иммунологические тесты, которые имеют особое значение для клинической практики.
К методам второго уровня относятся следующие реакции: преципитация, агглютинация, реакция связывания комплемента. Промежуточное положение между методами первого и второго уровней занимают исследования на изолированных клетках, например цитолиз или феномен освобождения медиаторов с участием эозинофилов.
3. Методы третьего уровня позволяют оценивать результаты реакции антиген-антитело в тканях или в организме в целом. В качестве примеров можно назвать модель анафилаксии in vitro (реакция Щульца-Дейла) и тестирование аллергенов с помощью кожных проб. Следует иметь в виду, что механизмы регуляции, степень готовности клеток, тканей и органов к иммунному реагированию вносят определенные коррективы в интерпретацию результатов реакции антиген-антитело. Подробнее в статье Реакции, основанные на феномене преципитации
Реакции, основанные на феномене агглютинации. В отличие от реакции преципитации при агглютинации антиген представлен в корпускулярной форме (прямая агглютинация эритроцитов или бактерий) либо связан на частицах носителя (непрямой вариант, пассивная агглютинация). Механизм агглютинации изучен еще не полностью. Согласно одной из теорий, главная роль принадлежит специфической адсорбции антител на поверхности клеток, что приводит к снижению поверхностного потенциала или повышению гидрофобных свойств мембраны. В пользу этой теории свидетельствует тот факт, что агглютинация, как и преципитация, в значительной мере зависит от присутствия микроколичеств электролитов. Согласно другой концепции, а это соответствует теории «решетки» Marrack, агглютинация происходит при условии, если один активный центр двухвалентного антитела соединяется с одной антигенной детерминантой, а второй активный центр — с другой детерминантой. Избыток или недостаток антител приводит к торможению агглютинации. Хотя такие свойства, как размеры частиц и структура Ig, вносят коррективы в интерпретацию данных, тем не менее важные аргументы свидетельствуют в пользу этой теории.
Подобно преципитации данный метод используют как полуколичественный анализ, с помощью которого определяют то максимальное разведение сыворотки, при котором еще возможна агглютинация. Результаты можно оценивать макроскопически. Чувствительность агглютинации значительно варьирует при использовании разных систем антиген-антитело. Кроме того, агглютинация — это более чувствительный метод, чем реакция преципитации (почти в 103 раз). При оптимальных условиях удалось выявить антитела с минимальной концентрацией да 0,05 мл. Ig известных классов обладают разными агглютинационными свойствами. Так, способность к агглютинации молекул IgM в 60-180 раз выше, чем молекул IgG.
Прямая реакция агглютинации происходит при условии, если антиген является элементом клеточной мембраны или присутствует на поверхности других частиц (эритроцитов, бактерий, частиц пыльцы). Постановка этой реакции осуществляется как в пробирках (тогда результаты оценивают после седиментации), так и в лунках, расположенных на специальной пластине. В частности, определение группы крови человека — это общепринятый экспресс-метод, также основанный на феномене агглютинации. Для идентификации группы крови каплю суспензии эритроцитов смешивают с каплей стандартной агглютинирующей сыворотки определенной специфичности: при положительной реакции агглютинаты видны уже макроскопически, если реакция отсутствует, то суспензия эритроцитов сохраняет гомогенность.
Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса). Антиглобулиновый тест служит для доказательства присутствия в сыворотке неагглютинирующих или «неполных» антител. Наиболее часто этот метод используют при диагностике болезней крови, обусловленных иммунным гемолизом. Первоначально исследователи применяли антиглобулиновую сыворотку (против глобулина человека), однако позднее было установлено, что она реагирует с компонентами комплемента. В настоящее время вместо нее интенсивно внедряют моноспецифические антисыворотки против определенных классов Ig (моноклональные антитела). Прямой вариант теста служит для обнаружения связанных с клеткой «неполных» антител; при непрямом варианте выявляют циркулирующие антитела: исследуемую сыворотку предварительно инкубируют с эритроцитами, а затем воспроизводят прямой тест. Разработана постановка антиглобулинового теста в комбинации с пассивной гемагглютинацией для выявления как неагглютинирующих аутоантител, так и реагинов. И, наконец, непрямая техника флюоресценции — это также одна из модификаций антиглобулинового теста.
Тест потребления антиглобулина (тест Штеффена). Следует обратить внимание на этот метод, хотя в данном случае мы имеем дело лишь с индикаторной реакцией. С помощью этого теста можно выявить антитела к антигенам клеток тканей, клеточных ядер или нерастворимых элементов тканей. Определить эти антитела с помощью реакции агглютинации невозможно. При непрямом варианте теста антигены (гомогенизированные ткани) инкубируют с исследуемой сывороткой, а затем тщательно отмывают для удаления несвязанных антител. Далее с этим гомогенатом инкубируют антиглобулиновую сыворотку с заранее известным титром. В результате происходит потребление антиглобулина антителами, адсорбированными на тканях. В соответствии с этим титр антиглобулиновой сыворотки снижается. Уровень исследуемых антител до и после инкубации определяют с помощью индикаторной системы, состоящей из сенсибилизированных неполными антителами эритроцитов, поэтому данный вариант можно рассматривать как модификацию реакции торможения гемагглютинации. При постановке прямого варианта теста предварительную инкубацию с исследуемой сывороткой не производят.
Данный метод применяют для определения аутоантител при ревматоидном артрите, антител к ДНК при системной красной волчанке, а также для доказательства выработки антител к антигенам на лейко- и тромбоцитах. Метод зависит и от многочисленных неспецифических факторов — вот почему особую важность приобретают соответствующие способы контроля. При интерпретации результатов не следует забывать, что общепринятая техника может демонстрировать связывание глобулинов, не всегда обусловленное комплексом антиген-антитело.
Реакция связывания комплемента. Это непрямой метод для выявления антител или антигенов. Реакция основана на том, что комплемент принимает участие в многочисленных реакциях типа антиген-антитело. Постановку опыта осуществляют в два этапа: на I этапе исследуемую сыворотку и известный антиген инкубируют с комплементом, на II — готовят индикаторную систему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов, и добавляют к смеси реагентов. Если I этап опыта завершается реакцией антиген-антитело, то происходит связывание комплемента, при этом гемолиз индикаторных эритроцитов отсутствует или выражен незначительно. Если в исследуемой системе не образуется комплекс антиген-антитело, то комплемент полностью включается в индикаторную систему, что приводит к гемолизу. В качестве источника комплемента обычно служит свежая сыворотка крови морской свинки. Ее комплемент реагирует с антителами всех видов млекопитающих. В индикаторной системе используют, как правило, эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к эритроцитам барана.
РСК — это довольно чувствительный метод, который позволяет выявить антитела в концентрации 0,05 мг/л, его применяют прежде всего при диагностике инфекционных заболеваний (сифилис, вирусные инфекции), а также в ряде случаев для доказательства аутосенсибилизации. Читать подробнее Иммунологические методы с использованием меченых антигенов и антител
Реакция иммунного гемолиза и цитотоксический тест. Иммунный гемолиз может служить доказательством, с одной стороны, активности комплемента, с другой — цитотоксического эффекта антител к эритроцитам, поэтому указанные реакции важны для иммуногематологической диагностики. Пассивную гемагглютинацию можно преобразовать в реакцию пассивного гемолиза, при этом смесь реагентов должна состоять из антител, эритроцитов, нагруженных соответствующим антигеном, и комплемента.
Цитологический тест информативен при изучении патогенетических механизмов. Тем не менее возможности его использования довольно ограничены, учитывая сложность методов клеточного культивирования. Цитотоксические реакции могут быть опосредованы антителами (активация комплемента), клетками-киллерами и сенсибилизированными Т-лимфоцитами.
Тест нейтрализации. Принцип теста состоит в том, что определенные биологические свойства антигена нейтрализуются при воздействии антител. Наиболее широко его применяют для выявления антитоксических (столбняк, дифтерия) и антивирусных антител.
Прочие методы. Кроме методов, ранее описанных в отдельных главах (анафилаксия in vitro по Шульцу-Дейлу, освобождение гистамина из базофильных гранулоцитов и тучных клеток, кожные пробы, «разрешающая» доза аллергена как тест оценки иммунного ответа, пассивная кожная анафилаксия и реакция Прауснитца-Кюстнера), следует назвать способы доказательства продукции IgE, диагностические тесты для анализа иммунных комплексов, методы выявления аутоантител при аутоиммунных заболеваниях.
Читать далее Моноклональные антитела
Количественное содержание иммуноглобулинов (IgА, IgМ, IgG) является основным показателем гуморального иммунного ответа и необходимо для оценки функциональной полноценности иммунной системы и диагностики патологических нарушений ее работы.
Определение уровня иммуноглобулинов является важным при диагностическом и клиническом мониторинге первичных иммунодефицитов, моноклональных гаммапатий, аутоиммунных заболеваний и других патологических состояний (Х-сцепленной агаммаглобулинемии, гипер-IgM, селективном IgА-дефиците, дефиците субклассов IgG, транзиторной гипогаммаглобулинемии новорожденных и др.). При первичных иммунодефицитах определение иммуноглобулинов имеет решающее диагностическое значение.
Снижение концентрации может свидетельствовать о различных патологиях – от генетических дефектов синтеза иммуноглобулинов до транзиторных состояний, связанных с потерей белка организмом. Причинами снижение синтеза иммуноглобулинов могут быть: моноклональные гаммапатии, термические ожоги, злокачественные лимфомы, плазмоцитомы, карциномы, болезни Ходжкина, заболеванияпочек, первичные и вторичные иммунодефициты.
При первичном контакте с антигеном сначала синтезируются IgM, затем IgG. При повторном – IgG синтезируются быстрее и в большем количестве. IgА нейтрализует вирусы и бактериальные токсины. Повышение концентраций говорит о наличии аллергических, аутоиммунных процессов, характерно для инфекционных заболеваний. Увеличение Ig разных классов отмечают при различных патологических ситуациях. Концентрация IgM возрастает в острый период и при обострении хронической инфекции, IgG – в стадии разрешения или формирования хронической инфекции, IgА – при некоторых вирусных инфекциях.
Метод исследования: >ИФА, иммунотурбидиметрия, иммунонефелометрия.
Условия взятия и хранения образца: Сыворотка крови. Хранение не более 24 ч при 4–8 °С. Допускается однократное замораживание образца.
Система комплемента
Система комплемента – комплекс белков, постоянно присутствующих в крови. Это каскадная система протеолитических ферментов, способных лизировать клетки, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов, участвует в реализации иммунного ответа организма. Является важным компонентом как врожденного, так и приобретенного иммунитета.
Она активизируется реакцией антиген-антитело и необходима для опосредованного антителами иммунного гемолиза и бактериолиза, играет важную роль при фагоцитозе, опсонизации, хемотаксисе и иммунном гемолизе и необходима для усиления эффекта взаимодействия между специфическими антителами и антигеном.
Одной из причин снижения факторов комплемента в сыворотке крови могут являться аутоантитела, направленные против факторов комплемента. Снижение С3 и С4 компонентов комплемента сопровождается клинической картиной рецидивирующего кожного геморрагического васкулита и артралгией.
Уровень компонентов комплемента в крови варьирует в широких пределах. Наследственный дефицит компонентов комплемента или их ингибиторов может приводить к аутоиммунным нарушениям, повторным бактериальным инфекциям, хроническим воспалительным состояниям.
С3-компонент комплемента – центральный компонент системы, белок острой фазы воспаления. Это важнейшая часть защитной системы против инфекций. Он образуется в печени, макрофагах, фибробластах, лимфоидной ткани и коже. Вследствие активации С3 выделяется гистамин из тучных клеток и тромбоцитов, хемотаксис лейкоцитов и соединение антител с антигеном, поддерживается фагоцитоз, усиливается проницаемость стенок сосудов и сокращение гладкой мускулатуры. Активация С3 играет важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний.
С4-компонент комплемента – гликопротеин, синтезируется в легких и в костной ткани. С4 поддерживает фагоцитоз, увеличивает проницаемость стенки сосудов, участвует в нейтрализации вирусов. Он участвует только в классическом пути активации системы комплемента. Увеличение или уменьшение содержания комплемента в организме наблюдается при многих заболеваниях.
Показания к исследованию
- Подозрение на врожденный дефицит комплемента, аутоиммунные заболевания, острые и хронические бактериальные и вирусные инфекции, (особенно рецидивирующие), онкологические заболевания;
- динамическое наблюдение больных с системными аутоиммунными заболеваниями.
Условия взятия и хранения образца: Сыворотка крови. Хранение не более 24 ч при 4–8 °С. Допускается однократное замораживание образца.
Метод исследования: ИФА, иммунотурбидиметрия, иммунонефелометрия.
Повышение концентрации С3 наблюдается при некоторых острых бактериальных, паразитарных и вирусных инфекциях, аутоиммунных и воспалительных заболеваниях.
Снижение концентрации С3 -наблюдается при врожденных дефектах комплемента, различных воспалительных и инфекционных, аутоиммунных заболеваниях, длительном голодании, при лечении цитостатиками, ионизирующем излучении.
Повышение концентрации С4 характерно для реакции острой фазы, отмечается при аутоиммунных заболеваниях, назначении некоторых лекарственных препаратов.
Снижение концентрации С4 – отмечается при врожденных дефектах системы комплемента (С4 дефицит новорожденных), некоторых аутоиммунных заболеваниях, системных васкулитах, синдроме Шегрена, трансплантации почек.
Циркулирующие иммунные комплексы
ЦИК в крови – показатель развития различных воспалительных процессов в организме и активности их течения. Повышение ЦИК наблюдается при острых и хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, вирусных гепатитах. ЦИК присутствуют у многих людей, страдающих СКВ и РА, особенно в тех случаях, когда есть осложнения в виде васкулитов. Существует положительная корреляция между активностью заболевания и уровнем ЦИК в крови. Формирование ЦИК представляет собой физиологический механизм защиты, приводящий к быстрому устранению либо эндогенных, либо экзогенных антигенов через ретикуло-эндотелиальную систему. Однако ЦИК обладают способностью связывать и активировать комплемент, что ведет к повреждению ткани. Выходя из кровотока в мелких сосудах, они могут откладываться в тканях, в гломерулах почек, в легких, коже, суставах, стенках сосудов. Клинически это часто проявляется гломерулонефритами, артритами, нейтропениями. Патологические реакции на иммунные комплексы могут быть обусловлены превышением скорости их образования над скоростью элиминации, дефицитом одного или нескольких компонентов комплемента или функциональными дефектами фагоцитарной системы. Высокий уровень ЦИК в сыворотке крови и/или в других биологических жидкостях наблюдается при многих воспалительных и злокачественных заболеваниях, что может стать причиной развития патологии. Определение ЦИК в сыворотке крови – важный маркер для оценки активности заболевания, особенно при аутоиммунных заболеваниях. Снижение концентрации ЦИК в течение заболевания или при лечении свидетельствует об угасании воспалительного процесса и эффективности терапии.
Методы исследования: Для определения ЦИК в сыворотке крови человека используют метод иммунонефелометрии и иммунотурбодиметрии.
Условия взятия и хранения образца: Сыворотка крови. Образец стабилен, не более 24 ч при 4–8 °С. Допускается однократное замораживание образца.
Показания к исследованию: Оценка и мониторинг активности аутоиммунных, аллергических и инфекционных заболеваний.
Повышенные значения
- Аутоиммунные заболевания;
- иммунокомплексные заболевания;
- острые бактериальные, вирусные, паразитарные, грибковые заболевания;
- сывороточная болезнь;
- коллагенозы;
- ревматизм;
- аллергические альвеолиты, васкулиты, феномен Артюса;
- гломерулонефрит;
- бронхиальная астма;
- миокардит.