Метод определения напряженности иммунитета при ящуре
ГОСТ 25384-82
(СТ СЭВ 2597-80)
Группа С79
Срок действия с 01.01.83
до 01.01.88*
_______________________________
* Ограничение срока действия снято
по протоколу Межгосударственного Совета
по стандартизации, метрологии и сертификации
(ИУС N 2, 1993 год). — Примечание изготовителя базы данных.
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР
ИСПОЛНИТЕЛЬ Ж.А.Шажко
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Член Коллегии А.Д.Третьяков
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. N 3155
Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот, свиней, верблюдов, а также на все виды диких парнокопытных и мозоленогих животных, восприимчивых к ящуру, и устанавливает методы лабораторной диагностики ящура.
Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораторий.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2597-80.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для проведения диагностических исследований на ящур отбирают стенки и содержимое афт (лимфа) на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиньи), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт отбирают пробы крови в момент температурной реакции у животных, а из трупов молодняка всех видов животных — лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу и мышцу сердца.
Для проведения ретроспективных диагностических исследований на ящур отбирают пищеводно-глоточную слизь. Отбор пищеводно-глоточной слизи производят в любое время после предполагаемого заболевания животных.
1.2. Для проведения диагностики серологическим методом отбирают не менее 5 г стенок или содержимого афт. Масса проб остальных материалов, предназначенных для выделения вируса ящура и его последующей идентификации, должна быть не менее 10 г.
При невозможности получения указанных количеств проб допускается отбирать максимально возможное количество патологического материала для проведения последующей расплодки вируса в культурах клеток.
1.3. Пробы патологического материала без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания — заливают консервирующей жидкостью. Для консервирования стенок и содержимого афт используют консервирующую жидкость, состоящую из равных объемов нейтрального глицерина и забуференного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток (без сыворотки). Пробы остального патологического материала консервируют растворами антибиотиков с широким спектром действия или глицерин-фосфатным буфером.
1.4. Флаконы с пробами снабжают этикеткой с указанием вида животных, наименования патологического материала и его количества, консерванта, времени отбора и адреса отправителя. Флаконы с пробами помещают в небьющийся контейнер со льдом или хладоносителем и доставляют на исследование в возможно короткий срок, но не позднее 48 ч с момента отбора. Если пробы могут быть доставлены в течение 6-12 ч с момента отбора, замораживание и консервация проб не обязательны.
1.5. Поступившие на исследование стенки афт освобождают от консервирующей жидкости отмыванием в 2-3 сменах стерильного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток, взвешивают, измельчают сначала ножницами, а затем в ступке с песком или с помощью гомогенизатора и смешивают в соотношении 1:1 или 1:2 с 0,15 М раствором хлористого натрия. Полученные 50 или 33% суспензии выдерживают в течение 20 мин при температуре 4 °С, а затем очищают 20% (по объему) хлороформа или флюорокарбона в течение 5-7 мин и осветляют центрифугированием с частотой вращения 3000 об/мин в течение 15 мин.
1.6. Содержимое афт (лимфа) разбавляют равным количеством 0,15 М раствора хлористого натрия и подвергают очистке и осветлению в соответствии с п.1.5.
1.7. Пробы лимфоузлов, мышцы сердца, поджелудочной железы и свернувшейся крови сначала обрабатывают в соответствии с п.1.5, а затем разбавляют средой для культивирования клеток.
Полученные суспензии при невозможности немедленно использовать для постановки биопробы замораживают и хранят при температуре минус 20 °С.
1.8. Суспензии, полученные в соответствии с пп.1.5 и 1.6, делят на три неравные части. Меньшую из них (около 1 см), предназначенную для вирусологических исследований (постановки биопробы), консервируют антибиотиками и хранят при температуре минус 20 °С. Другую часть (2-3 см), предназначенную для исследования в РСК, прогревают при температуре 56 °С в течение 40 мин, а оставшуюся (1,5-2 см) — хранят без прогревания. Перед постановкой РСК обе эти пробы центрифугируют в течение 20 мин с частотой вращения 3500-4000 об/мин.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Серологический метод
Сущность метода заключается в обнаружении специфического антигена того или иного типа и варианта вируса ящура непосредственно в материале, полученном от животных с клиническими признаками заболевания, с помощью реакции связывания комплемента (РСК).
2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы
2.1.1.1. Для проведения исследования применяют:
центрифугу настольную с угловым ротором и частотой вращения до 5000 об/мин;
центрифугу рефрижераторную;
холодильник с температурой минус 20 °С;
холодильник с температурой от 0 до 8 °С;
гомогенизатор;
баню водяную или термостат;
шкаф сушильный с регулируемой температурой в диапазоне от 100 до 200 °С;
электрофотоколориметр или спектрофотометр;
пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-75;
пластинки (панели) для микросерологических реакций типа Такачи;
наборы разбавителей и капельниц для микросерологических реакций типа Такачи;
пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 и 0,1 см по ГОСТ 20292-74*;
________________
* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91, здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.
колбы мерные вместимостью 50, 100 и 200 см по ГОСТ 1770-74;
комплемент морской свинки с титром не более 2,8% по ГОСТ 16446-78;
гемолизин кроличий к эритроцитам барана с титром 1:8000 по ГОСТ 16446-78;
эритроциты барана в виде дефибринированной крови, смешанной с равным объемом консерванта;
сыворотки морских свинок семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса ящура с титром в РСК не ниже 1:20;
антигены ящурные эталонные семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса с титром в РСК не ниже 1:4;
сыворотки и антигены для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний свиней;
кислоту борную дважды перекристаллизованную;
веронал;
мединал;
глюкозу по ГОСТ 975-75*;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 975-88. — Примечание изготовителя базы данных.
натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;
магний хлористый по ГОСТ 4209-77, х.ч.;
кальций хлористый по ГОСТ 4460-77, х.ч.;
среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактальбумина (рН 7,4-7,6);
хлороформ по ГОСТ 20015-74* или флюорокарбон-113;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 20015-88. — Примечание изготовителя базы данных.
консервант для эритроцитов; приготовленный следующим образом: последовательно растворяют в 100 см дистиллированной воды 6 г глюкозы, 4,5 г борной кислоты, дважды перекристаллизованной, и 0,85 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют кипячением в течение 3 дней по 30 мин;
раствор буферный веронал-мединаловый концентрированный, приготовленный следующим образом: растворяют в 1000 см кипящей дистиллированной воды 83 г хлористого натрия, 18,4 г веронала, 1,15 г хлористого магния и 0,22 г хлористого кальция. Раствор охлаждают, затем растворяют 0,22 г мединала, стерилизуют автоклавированием и хранят при температуре 4 °С. Рабочий раствор готовят непосредственно перед постановкой РСК разбавлением концентрированного раствора четырьмя объемами дистиллированной воды.
2.1.2. Подготовка к исследованию
2.1.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, разводят с 1:2 до 1:32 0,15 М раствором хлористого натрия, вероналовым буфером или средой для культивирования клеток и разливают в серологические пробирки по 0,1 см или в лунки панелей для микросерологических реакций по 0,025 см. Число пробирок (лунок), заполняемых каждым разведением исследуемой суспензии, должно быть равно числу штаммоспецифических сывороток и контролей на антикомплементарность и гемолитические свойства.
2.1.2.2. Для приготовления гемолитической системы эритроциты барана трехкратно отмывают от консерванта 0,15 М раствором хлористого натрия, каждый раз осаждая их центрифугированием с частотой вращения 600 об/мин в течение 5-7 мин и готовят рабочую суспензию смешиванием 2 см осадка с 98 см разбавителя. К полученной суспензии эритроцитов при постоянном перемешивании приливают постепенно равный объем гемолизина, разведенного 0,15 М раствором хлористого натрия с таким расчетом, чтобы его конечное разведение было в 4 раза концентрированнее предельного гемолитического титра, указанного на этикетке. Затем суспензию выдерживают в течение 15-20 мин в водяной бане при температуре 37 °С или при комнатной температуре.
При постановке РСК на панелях для микрореакций концентрацию эритроцитов в гемсистеме увеличивают в 2 раза.
2.1.2.3. Для приготовления рабочего разведения комплемента содержимое нескольких ампул с сухим препаратом растворяют в первоначальном объеме дистиллированной воды, определяют предельный титр, обусловливающий гемолиз 50% эритроцитов гемсистемы, приготовленной согласно п.2.1.2.2, и разводят 0,15 М раствором хлористого натрия или вероналовым буфером из расчета 5 CH в 0,1 см (если РСК ставят в пробирках) или в 0,025 см (при постановке РСК на панелях для микрореакций).
2.1.2.4. Рабочие разведения типоспецифических ящурных сывороток готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере из расчета получения раствора в 2 раза более концентрированного, чем их предельный титр, т.е. они должны содержать 2 сывороточных единицы (СЕ). Вариантноспецифические сыворотки разводят до предельного титра. Вместо типоспецифических сывороток могут быть использованы вариантноспецифические в предельном, двух- и четырехкратном титрах (1, 2 и 4 СЕ).
2.1.2.5. Рабочие разведения эталонных (контрольных) яшурных антигенов готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере. Они должны быть в 2 раза концентрированнее, чем их предельный титр, т.е. должны содержать 2 антигенных единицы (АЕ).
2.1.2.6. Рабочие разведения сывороток и антигенов для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний сельскохозяйственных животных готовят по пп.2.1.2.4 и 2.1.2.5.
2.1.3. Проведение исследования
2.1.3.1. В пробирки (лунки), заполненные в соответствии с п.2.1.2.1, вносят равные объемы штаммоспецифических сывороток, взятых в рабочем титре, и рабочего разведения комплемента, содержащие 5 CH. В контролях исследуемого патологического материала на антикомплементарность заменяют сыворотки равным объемом разбавителя, а в контроле на гемолитические свойства — разбавителем заменяют и комплемент. Все полученные смеси тщательно встряхивают и помещают в водяную баню пли термостат при 37 °С на 30 мин, после чего к ним добавляют суспензию эритроцитов, сенсибилизированных гемолизином, в объеме 0,2 см (пробирки) или 0,05 см (лунки), энергично встряхивают и выдерживают при 37 °С в течение 20 мин.
Пробирки или панели извлекают из термостата или водяной бани и осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5 мин с частотой вращения 600 об/мин или отстаиванием в течение 2-3 ч при комнатной температуре.
При исследовании недоброкачественных афтозных материалов, а также при исследовании сердечной мышцы объем исследуемых суспензий увеличивают в 4 раза при сохранении объема и концентрации остальных компонентов реакции в обычных пределах.
Для повышения чувствительности РСК применяют реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), при которой первая фаза протекает при 4 °С в течение 16-20 ч.
2.1.4. Обработка результатов
Оценку результатов проводят визуально.
Реакцию считают положительной, если в ряду пробирок (лунок) с какой-либо штаммоспецифической сывороткой отмечается задержка гемолиза не менее 50% эритроцитов при полном гемолизе в параллельных рядах с другими штаммоспецифическими сыворотками и в контроле с пробами патологического материала на антикомплементарность. Возбудитель относится к тому варианту вирусов ящура, с сывороткой которого титр исследуемой суспензии окажется выше.
Отрицательная реакция не исключает ящура или иного сходного с ним заболевания, поскольку концентрация вирусоспецифического антигена в исследуемом материале может оказаться слишком низкой для обнаружения в РСК.
2.2. Методы выявления вируса
Сущность методов заключается в выявлении биологического действия вируса на восприимчивые и чувствительные биологические системы и его последующей идентификации серологическим методом.
2.2.1. Аппаратура, материалы и растворы
2.2.1.1. Для проведения исследования применяют:
термостат с температурой нагрева 37 °С;
пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 см по ГОСТ 20292-74;
культуры монослойные первичных клеток почки свиней (СП), телят, взрослого крупного рогатого скота (ВП) и ягнят (ПЯ) и перевиваемых линий ВНК-21 и IB-RS-2 в пробирках и флаконах вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см;
среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактабумина (рН 7,4-7,6);
среду питательную Игла для культивирования клеток перевиваемых линий;
раствор Хенкса солевой, рН 7,2-7,4.
2.2.2. Подготовка к исследованию
2.2.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, и оказавшиеся неактивными в РСК, а также суспензии лимфатических узлов, сердечной мышцы, поджелудочной железы, свернувшейся крови и пищеводно-глоточную слизь, полученные в соответствии с пп.1.7 и 1.9, используют для заражения монослойных культур первичнотрипсинизированных клеток (СП, ВП, ПЯ, щитовидной железы крупного рогатого скота), перевиваемых линий (ВНК-21 и IB-RS-2), десять мышат 3-6-дневного возраста и пять морских свинок. Допускается заражение двух голов крупного рогатого скота в 18-месячном возрасте и четырех поросят 3-месячного возраста, не содержащих в крови специфических антител.
2.2.3. Проведение исследования
2.2.3.1. Проведение биопробы на культурах клеток
Отбирают пробирки (флаконы) с хорошо сформированным монослоем без признаков старения и неспецифической дегенерации. На каждую пробу исследуемого материала берут по 10 пробирок или по 2-3 флакона с перечисленными клеточными культурами. Непосредственно перед инокуляцией культуры дважды отмывают от ростовой питательной среды раствором Хенкса. Затем в пробирочные культуры вносят по 0,1-0,2 см, а во флаконы от 0,5 до 10 см (в зависимости от площади монослоя) исследуемых суспензий. Инокулированные культуры выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 60 мин, затем освобождают от исследуемой суспензии и заливают поддерживающей питательной средой. Одновременно ставят контроль на цитотоксичность раствора Хенкса. Инокулированные контрольные культуры помещают в термостат при температуре 37 °С и в течение 7 дней проводят микроскопию для выявления дегенерации клеток. В случае обнаружения дегенерации только в инокулированных культурах проводят дополнительный пассаж культуральной суспензии, полученной после однократного промораживания культур с дегенерацией монослоя при температуре минус 20 °С. Полученную при этом суспензию осветляют центрифугированием в течение 15 мин с частотой вращения 3000 об/мин и затем заражают исходные культуры в том же порядке, который предусмотрен для исследуемых суспензий проб патологического материала.
Специфичность дегенерации клеток проверяют в РСК.
2.2.3.2. Постановка биопробы на животных
Биопробу ставят на морских свинках, мышатах 3-6-суточного возраста и естественно-восприимчивых к ящуру животных.
Используют клинически здоровых особей, в анамнезе которых полностью исключены предварительные контакты с вирусом ящура. Мышатам исследуемую суспензию инокулируют подкожно в дозе 0,1 см, морским свинкам — в кожу подушечек обеих задних конечностей методом тунелирования в дозе 0,2-0,5 см. Крупному рогатому скоту материал вводят в толщу эпителия языка и в мякиши всех конечностей в дозе 2-3 см. За инокулированными животными наблюдают в течение 7 дней. В случае гибели подопытных мышат проводят дополнительный пассаж материала, приготовленного из тушек павших мышат, и исследование в РСК в соответствии с п.2.1.
При появлении у остальных видов животных везикулярных поражений кожи в местах инокуляции исследуемого материала отбирают пробы содержимого афт в соответствии с п.1.2, готовят из них суспензии в соответствии с пп.1.5 и 1.6 и исследуют в РСК в соответствии с п.2.1.
2.2.4. Обработка результатов
2.2.4.1. Пробу исследуемого патологического материала считают отрицательной, если во втором и последующем пассажах не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышат, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.
Электронный текст документа
подготовлен ЗАО «Кодекс» и сверен по:
официальное издание
М.: Издательство стандартов, 1982
Таблица 104 — Параметры лунок, рекомендуемые для постановки РИД
| Показатели | 1 вар | 2 вар |
| Диаметр центральной лунки для антигена мм | ||
| Диаметр периферических лунок для сыворотки мм | ||
| Расстояние между центральной и периферической лунками мм |
Минимальные необходимые требования, которым должен удовлетворять диагностический набор, заключаются в следующем: АГ должен содержать оболочечный гликопротеин ВБЛ, стандартизованный по референтной сыворотке Е-1; референтная сыворотка Е-4, разведенная отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, должна быть выявлена как положительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Референтные сыворотки Е-1 и Е-4 изготовлены в Национальной ветеринарной лаборатории Дании (P.O. Box 373, DK-1503 Copengagen) и предназначены для стандартизации всех диагностических наборов для постановки РИД и ИФА.
Реакцию учитывают через 48 ч и при следующих показаниях контролей: наличие четкой контрольной полосы преципитации между АГ и специфической положительной сывороткой и отсутствие таковой с отрицательной контрольной сывороткой. Животных, сыворотки крови которых положительно прореагировали в РДП, считают зараженными ВЛКРС.
Описаны модификация метода иммунодиффузии — усиленная танином непрямая двойная иммунодифузия в геле (НИД-Р) и её применение для выявления AT и АГ ВЛКРС. Современная диагностика энзоотического лейкоза КРС основана большей частью на тестах иммунодифузии и ELISA. При использовании РИД необходимо придерживаться рекомендаций производителя очень дорогого АГ. В целях снижения затрат при сохранении надежности результатов югославские исследователи уменьшили размер отверстий в розетке и слой агара в чашке Петри, сохраняя прежнюю чувствительность теста.
Предложен метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла. Метод рекомендован для получения очищенного вируса и специфического АГ. Молдавскими исследователями показано значительное преимущество РИД при исследовании молозива: титр AT был в 8-32 раза выше, чем в пробах сыворотки крови; исследовать необходимо первые порции молозива. Аналогичные данные получены сотрудниками ВИЭВ. Титр AT к gp51 и р24 ВЛ КРС сразу после отела был наивысшим — 1:2187-1:59049 в ИФА и 1:16-1:512 в РДП. Через 1 сут титр AT составлял 25% от исходного.
РАЛ. В качестве теста для прижизненной диагностики лейкоза КРС можно использовать иммунохимическую реакцию агглютинации с латексом в соответствии с временными методическими рекомендациями. Животные, сыворотки крови которых дали положительную реакцию агглютинации с латексом, подлежат тщательному обследованию на лейкоз другими методами. Данная реакция перспективна для прижизненной диагностики лейкозов. Испытание этой реакции показало в 67% случаев совпадение результатов с гематологическими и около 90% с гистологическими методами диагностики гемобластозов КРС.
ИФ. Менее широко применяют для обнаружения AT в сыворотках крови инфицированных животных. При этом используют в качестве клеток-мишеней перевиваемые культуры, иронически инфицированные ВЛКРС.
РНГА. Является чувствительным методом обнаружения AT в сыворотке крови и молоке. Рекомендуют использовать при экспертизе и санитарной оценке молока. Наибольший Процент совпадений гематологических показателей с результатами серологических исследований был отмечен в РНГА.
ELISA. Широко применяют в США, Бельгии с использованием монАТ для широкомасштабного выявления энзоотического лейкоза в стадах КРС. Чувствительность его выше, чем РДП. Метод ELISA при диагностике лейкоза КРС может существенно повысить чувствительность серодиагностики по сравнению с РДП. Он удобен для систематического контроля молока коров благополучных хозяйств.
ELISA с монАТ ставят с пулом сывороток крови, объединенных от животных одного стада. Предложено выявлять инфицированность ВЛКРС по наличию AT в молозиве коров ELISA. Все образцы молока, взятые от больных коров, позитивных по AT к вирусу в сыворотках, оказались положительными. Во ВНИИВиМ получены 6 гибридом, секретирующих монАТ к ВЛКРС. На основе мон AT к gp51 предложен «сэндвич» вариант ИФА для выявления вирусного АГ. Установлено, что структура и доступность антигенных детерминант варьирует в разных системах титрования. Внесение радиоактивной метки может изменять конфигурацию АГ сайтов, что сказывается на результатах исследования сывороток. Анти ВЛ КРС AT конкурировали со специфическим пероксидазным конъюгатом на основе монАТ за связывание с gp51.
Первым этапом в постановке «классического » варианта ИФА для выявления AT против ВЛКРС является непосредственное покрытие лунок микропанелей вирусным АГ. При этом получают большой процент ложноположительных результатов из-за неспецифического взаимодействия невирусных компонентов АГ с испытуемыми сыворотками. Более того, использование очищенных вирусных белков в качестве АГ экономически неоправданно и не позволяет получать стандартный препарат, что сказывается на воспроизводимости результатов ИФА. Поэтому в настоящее время почти все наборы для постановки ИФА изготавливаются с использованием захвата AГ AT, сорбированными на стенки лунок микропанелей. Существующие варианты ИФА включают 5 принципиальных этапов постановки реакции.
Этап I. Реагенты для захвата АГ: а).монАТ против gp51; б).монАТ против р24; в).Поликлональные AT (gp51+p24) КРС. Этап 2. Антиген:
а) надосадочная жидкость после культивирования клеток FLK-BLV;
б) культуральная жидкость, содержащая продукты генов env или gag ВЛКРС, экспрессируемые рекомбинантными векторами. Этап 3. Испытуемые сыворотки. Этап 4. Реагенты для обнаружения иммунного комплекса.
Непрямые варианты ИФА: монАТ против бычьего IgG; полиАТ против бычьего IgG.
Конкурентный или блокирующий варианты ИФА: а) монАТ против gp51 (направленные против других эпигонов нежели использованных на этапе 1a); 6) Бычьи поликлональные AT (такие, как на этапе 1в)
Этап 5. Цветная индикация. Реагенты для индикации иммунного комплекса (этап 4) можно метить биотином или ферментами, чаще используют пероксидазу хрена. При постановке ИФА каждая микропанель должна содержать лунки, заполненные положительной и отрицательной контрольными сыворотками.
ИФА позволяет выявлять AT в титрах в 10-100 раз меньших, чем обнаруживает РИД. Все коммерческие наборы ИФА должны быть стандартизированы по референтной сыворотке Е-4. Причем, процедура стандартизации предусматривает 3 возможных варианта использования наборов ИФА для исследования: 1) индивидуальных проб сыворотки; 2) индивидуальных проб молока; 3) пулов сыворотки и молока.
Поскольку в молоке AT к ВЛКРС в 25 раз больше, чем в сыворотке крови, модифицированный ELISA должен обладать высокой чувствительностью. При диагностике лейкоза КРС качество используемых диагностикумов имеет первостепенное значение. Наиболее пригодным для ИФА в качестве АГ являются препараты вируса, полученные 2-кратным высокоскоростным центрифугированием и синтетический пептид. В Швеции разработан ELISA для исследования молока и сывороток крови. В Бельгии рекомендован конкурентный ELISA с использованием монАТ и меченного пероксидазой конъюгата анти-gpS 1. МонАТ Д9 и F11 против лимфоцитов больных лейкозом животных связываются с АГ лимфоцитов крови больного КРС, «не распознают» АГ, ассоциированные с лейкозом. ELISA с использованием монАТ, превосходит непрямой тест ELISA.
Параллельно с ИФА AT определяли РИД и электрофореза в полиакриламидном геле. Чувствительность ИФА, испытанного в 5 лабораториях Германии, составляла в среднем 97,6%, что в 4 раза выше РИД. Специфичность ИФА равнялась в среднем 98,1 % . При использовании АГ из культуральных жидкостей клеток почки эмбриона ягнят, персистентно инфицированных ВЛКРС в положительных сыворотках с помощью иммуноблотинга, обнаруживали AT к р24, р15, р12, pl0, gp30, и gp51. В иммуноблотинге оказались активными монАТ к р24 и gp51. Данный метод оказался более чувствительным, чем иммунодиффузия в агаровом геле и ИФА. В ИФА возможно использование синтетических пептидов -фрагментов структурного гликопротеина gp51, синтезированных во ВНИИЗЖ.
Аллергическая реакция. Разработан аллерген для диагностики лейкоза у животных. Для проведения аллергических реакций наиболее подходящее место хвостовая складка у овец и КРС и дорсальная поверхность уха у свиней.
Дифференциальный диагноз. Лейкоз необходимо отличать от актиномикоза, туберкулеза, паратуберкулеза и бруцеллеза. При актиномикозе поражаются, главным образом, лимфоузлы головы и грудной области (подчелюстные, заглоточные, околоушные и др.). Они плотной консистенции, с инкапсулированными абсцессами. В центре актиномикозного узла (гранулемы) гистологически обнаруживают друзы гриба. При туберкулезе чаще поражения в виде узелков, имеющих специфическое гистологическое строение, находятся в легких, кишечнике. Для паратуберкулеза характерно наличие изменений в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. В кишечнике развиваются продуктивное воспаление и очаговые инфильтраты из эпителиоидных клеток, в результате чего стенка утолщается в 5 и более раз. В лимфоузлах отмечают обширные скопления из эпителиоидных элементов с наличием среди них гистиоцитов и клеток типа Лангерганса. Специфическим методом окраски выявляют бактерии паратуберкулеза, локализующиеся в эпителиоидных и гигантских клетках. Бруцеллез диагностируют с помощью РСК, РА и аллергической пробы.
Ящур — остро протекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени; у молодых животных — поражением миокарда и скелетных мышц.
Возбудитель: РНК — содержащий вирус, относящийся к роду Aphthovirus,сем. Picornaviridae, имеющий 7 серологических типов (О, А, С; SАТ-1, SАТ-2, SАТ-3, Азия-1). Вирион вируса имеет форму икосаэдра, размером диаметра 25 нм, содежит 31% РНК и 69% белка. В организме естественно восприимчивых животных вирус индуцирует образование типоспецифических ВНА, КСА и ПА. Резистентность переболевших животных к повторному заражению связана с титром ВНА. Вирус ящура устойчив во внешней среде, особенно в высушенном состоянии, при сухом воздухе, отсутствии света, при пониженной температуре. Так, при влажности 30-40% и температуре 180С высушенный вирус сохраняется в течение 2 лет.
Лабораторная диагностика ящура основана на эпизоотологических данных, клинических признаках болезни, патологических изменениях и лабораторных исследованиях. Подозрение на ящур вызывает любое заболевание восприимчивых животных, характеризующееся появлением везикулярной сыпи в ротовой полости, на конечностях и вымени, повышенной саливацией, чмоканьем, затрудненным приемом и пережевыванием корма, а при осмотре ротовой полости — обнаружением афт и эрозий. Кроме того, обращают внимание на продолжительную яромоту, афты на венчике и в области межкопытной щели, иногда спадение рогового башмака, афты на сосках и болезненность последних при доении и сосании с сильно выраженным защитным рефлексом.
Эпизоотологический диагноз — высокая контагиозность, избирательное поражение только парнокопытных. Методы лабораторной диагностики ящура варьируют в зависимости от того, необходимы ли раннее обнаружение и типовая (вариантная) идентификация вируса (ранняя диагностика) или обнаружение и идентификация специфических противоящурных АТ у животных-реконвалесцентов (ретроспективная диагностика).
Лабораторная диагностика основана на выделении вируса, индикации, идентификации и типировании вируса ящура.
Выделение вируса. Эффективность выделения вируса из патологического материала повышается при использовании методов очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий. Благодаря удобству выполнения, экономичности, а главное, возможности быстрого получения результатов, позволяющих одновременно определить типовую и вариантную принадлежность эпизоотического вируса, чаще всего применяют РСК или РДСК. Однако, когда доставленное количество вирусного материала недостаточно для исследования или РСК дает отрицательный результат или неспецифическую задержку гемолиза, то ставят боиопробу на КРС (не менее 2 голов) в возрасте 18 мес, вводя 0,1 мл суспензии полученного; материала в несколько точек слизистой оболочки языка и мякишей конечностей; общий объем испытуемого материала 2-3 мл. Появление афт на месте введения материала с последующим подтверждением в РСК свидетельствует о наличии ВЯ. Однако метод дорог и связан с опасностью выноса вируса за пределы учреждения. Поэтому в диагностической практике он применяется очень редко. Чаще для биопробы используют мышат-сосунков 4-6-дн возраста, морских свинок массой не менее 500 г и первичную культуру клеток почек телят, поросят, ягнят, щитовидной железы КРС и перевиваемые клетки — ВНК-21, IB-RS-2. Биопроба на мышах удобна и экономична. ИД5о испытуемого штамма на мышатах-сосунах и крупном рогатом скоте одинаковы. Мышата-сосуны более чувствительны к вирусу ящура, чем морские свинки. Однако необходимо иметь в виду, что оценка результатов титрования на мышатах-сосунках нередко затруднительна.
Морские свинки легко заражаются при интрадермальном введении вируссодержащего материала в плантарную поверхность задних лапок в дозе 0,2-0,5 мл. Заражают не менее 5 голов. Первичные поражения обычно появляются через 2-5 дн (по мере созревания). Вторичные поражения — везикулы в ротовой полости — обычно развиваются при заражении штаммами, адаптированными к морским свинкам.
Для выделения вируса чаще всего используют культуру первично-трипсинизированных клеток почек свиней или телят. Наблюдение за инфицированными культурами клеток ведут 7 дн, микроскопируя их ежедневно. Специфическая дегенерация клеток при подтверждении её специфичности в РСК свидетельствует о наличии ВЯ в испытуемом материале.
Индикация и идентификация вируса. В качестве экспресс-метода в настоящее время широко применяется ПЦР. Это быстры и чувствительный метод обнаружения ВЯ в тканях путем энзиматической амплификащи РНК гена полимеразы.
РСК по 100%-ному гемолизу. Применяется для определения типов и подтипов (вариантов) ВЯ, вызвавших заболевание животных, а также для проверки производственных штаммов ВЯ при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научно-исследовательской работе.
Антигенное родство (R) более 70% свидетельствует о том, что штаммы по антигенным свойствам идентичны друг другу и относятся к одному и тому же варианту, от 10 до 70% — к различным вариантам (подтипам) и менее 10%- к различным типам.
РСК по 50%-ному гемолизу. Успешно применяют в работе научно-исследовательских лабораторий и учреждений биологической промышленности. Разработан способ изучения иммунного статуса вакцинированных против ящура животных в РСК. Он позволяет специалистам на уровне областных ветлабораторий проводить мониторинг за иммунным состоянием стад в простой и достоверной реакции.
РПГА. Это простой, ускоренный, чувствительный метод идентификации ВЯ. По чувствительности реакция превосходит общепринятый метод типирования ВЯ в РСК в 8-16 раз. Сущность её заключается в том, что нагруженные AT эритроциты агглютинируются при контакте с ящурным АГ гомологичного типа.
Типирование ВЯ.Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета. Испытание перекрестного иммунитета на КРС с целью определения типовой принадлежности полевого штамма ВЯ проводится лишь в том случае, если по лабораторным тестам обнаруживается новый тип ВЯ, ранее не встречавшийся в стране. Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета возможно и на морских свинках.
Штаммы считают идентичными, если вакцина предохраняет животных от развития генерализованного процесса при заражении используемыми штаммами. В случае иммунологического отличия штаммов вакцинированные животные, инфицированные гетерологичным штаммом, заболевают генерализованной формой ящура.
При определении в культуре леток типа ВЯ его относят к тому типу, сыворотка против которого предотвращает ЦПД. Разработан вариант универсальный эритроиммуноадсорбции (УЭИА), позволяющий определять АГ ВЯ в более высоких титрах, чем в РСК и РПГА.
ИФА. Высокоэффективен для выявления как 146S-, так и 125-компонентов ВЯ. Этот метод в 500 раз чувствительнее РСК при исследовании проб афтозного эпителия. Установлена высокая степень специфичности и чувствительности ELISA для идентификации и типирования ВЯ всех 7 серотипов в эпителиальных тканях. Установлена высокая чувствительность сэндвич-варианта ИФА (на основе щелочной фосфатазы), который по эффективности превосходит в 207-219 раз, а с хромогенными субстратами — в 4-64 раза.
ИФА может быть пригодной в системе лабораторной диагностики ящура при исследовании диагностических штаммов. Для выявления AT к ВЯ в ИФА можно использовать пробы крови, высушенной на фильтровальной бумаге. Первоначальный объем гепаринизированной крови равен 7,65 мкл.