Методами оценки гуморального иммунитета

1. Методы первого уровня основаны на доказательстве взаимодействия в системе антиген-антитело. Положительные результаты свидетельствуют о специфичности реакций. В принципе можно выделить три типа реакций:

— тест конъюгации. При этом маркируют один из реагентов, результаты оценивают по его связыванию с другими реагентами на основании физических или химических свойств конъюгата (прямая иммунофлюоресценция, иммунопероксидазный метод, ауторадиография);

— тесты, основанные на изменении свойств одного из реагентов (например, изменение флюоресценции, электрического потенциала, вязкости раствора; синтез соединений с более высокой молекулярной массой, изменение ферментативной активности антигенов). Эти тесты обладают ограниченными возможностями;

— тесты, основанные на отделении комплекса антиген-антитело от несвязанных реагентов с помощью техники высаливания, преципитации, использования специфических антител или адгезии на клеточной поверхности. К ним следует отнести большинство радио- и иммуноферментных методов.

2. Методы второго уровня основаны на более сложном характере взаимодействия между антигеном (поливалентным) антителом (по меньшей мере двухвалентными антителами). При этом механизмы преципитации, агглютинации и т. д., лежащие в основе комплекса, в большей степени, чем при методах первого уровня, зависят от рН, ионной силы и других условий реакции. Поэтому положительные результаты не всегда определяют степень выраженности реакции антиген-антитело, а отрицательные еще не означают отсутствия этой реакции. Тем не менее, среди методов этой группы можно отметить и такие иммунологические тесты, которые имеют особое значение для клинической практики.

К методам второго уровня относятся следующие реакции: преципитация, агглютинация, реакция связывания комплемента. Промежуточное положение между методами первого и второго уровней занимают исследования на изолированных клетках, например цитолиз или феномен освобождения медиаторов с участием эозинофилов.

3. Методы третьего уровня позволяют оценивать результаты реакции антиген-антитело в тканях или в организме в целом. В качестве примеров можно назвать модель анафилаксии in vitro (реакция Щульца-Дейла) и тестирование аллергенов с помощью кожных проб. Следует иметь в виду, что механизмы регуляции, степень готовности клеток, тканей и органов к иммунному реагированию вносят определенные коррективы в интерпретацию результатов реакции антиген-антитело. Подробнее в статье Реакции, основанные на феномене преципитации

Реакции, основанные на феномене агглютинации. В отличие от реакции преципитации при агглютинации антиген представлен в корпускулярной форме (прямая агглютинация эритроцитов или бактерий) либо связан на частицах носителя (непрямой вариант, пассивная агглютинация). Механизм агглютинации изучен еще не полностью. Согласно одной из теорий, главная роль принадлежит специфической адсорбции антител на поверхности клеток, что приводит к снижению поверхностного потенциала или повышению гидрофобных свойств мембраны. В пользу этой теории свидетельствует тот факт, что агглютинация, как и преципитация, в значительной мере зависит от присутствия микроколичеств электролитов. Согласно другой концепции, а это соответствует теории «решетки» Marrack, агглютинация происходит при условии, если один активный центр двухвалентного антитела соединяется с одной антигенной детерминантой, а второй активный центр — с другой детерминантой. Избыток или недостаток антител приводит к торможению агглютинации. Хотя такие свойства, как размеры частиц и структура Ig, вносят коррективы в интерпретацию данных, тем не менее важные аргументы свидетельствуют в пользу этой теории.

Подобно преципитации данный метод используют как полуколичественный анализ, с помощью которого определяют то максимальное разведение сыворотки, при котором еще возможна агглютинация. Результаты можно оценивать макроскопически. Чувствительность агглютинации значительно варьирует при использовании разных систем антиген-антитело. Кроме того, агглютинация — это более чувствительный метод, чем реакция преципитации (почти в 103 раз). При оптимальных условиях удалось выявить антитела с минимальной концентрацией да 0,05 мл. Ig известных классов обладают разными агглютинационными свойствами. Так, способность к агглютинации молекул IgM в 60-180 раз выше, чем молекул IgG.

Прямая реакция агглютинации происходит при условии, если антиген является элементом клеточной мембраны или присутствует на поверхности других частиц (эритроцитов, бактерий, частиц пыльцы). Постановка этой реакции осуществляется как в пробирках (тогда результаты оценивают после седиментации), так и в лунках, расположенных на специальной пластине. В частности, определение группы крови человека — это общепринятый экспресс-метод, также основанный на феномене агглютинации. Для идентификации группы крови каплю суспензии эритроцитов смешивают с каплей стандартной агглютинирующей сыворотки определенной специфичности: при положительной реакции агглютинаты видны уже макроскопически, если реакция отсутствует, то суспензия эритроцитов сохраняет гомогенность.

Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса). Антиглобулиновый тест служит для доказательства присутствия в сыворотке неагглютинирующих или «неполных» антител. Наиболее часто этот метод используют при диагностике болезней крови, обусловленных иммунным гемолизом. Первоначально исследователи применяли антиглобулиновую сыворотку (против глобулина человека), однако позднее было установлено, что она реагирует с компонентами комплемента. В настоящее время вместо нее интенсивно внедряют моноспецифические антисыворотки против определенных классов Ig (моноклональные антитела). Прямой вариант теста служит для обнаружения связанных с клеткой «неполных» антител; при непрямом варианте выявляют циркулирующие антитела: исследуемую сыворотку предварительно инкубируют с эритроцитами, а затем воспроизводят прямой тест. Разработана постановка антиглобулинового теста в комбинации с пассивной гемагглютинацией для выявления как неагглютинирующих аутоантител, так и реагинов. И, наконец, непрямая техника флюоресценции — это также одна из модификаций антиглобулинового теста.

Тест потребления антиглобулина (тест Штеффена). Следует обратить внимание на этот метод, хотя в данном случае мы имеем дело лишь с индикаторной реакцией. С помощью этого теста можно выявить антитела к антигенам клеток тканей, клеточных ядер или нерастворимых элементов тканей. Определить эти антитела с помощью реакции агглютинации невозможно. При непрямом варианте теста антигены (гомогенизированные ткани) инкубируют с исследуемой сывороткой, а затем тщательно отмывают для удаления несвязанных антител. Далее с этим гомогенатом инкубируют антиглобулиновую сыворотку с заранее известным титром. В результате происходит потребление антиглобулина антителами, адсорбированными на тканях. В соответствии с этим титр антиглобулиновой сыворотки снижается. Уровень исследуемых антител до и после инкубации определяют с помощью индикаторной системы, состоящей из сенсибилизированных неполными антителами эритроцитов, поэтому данный вариант можно рассматривать как модификацию реакции торможения гемагглютинации. При постановке прямого варианта теста предварительную инкубацию с исследуемой сывороткой не производят.

Данный метод применяют для определения аутоантител при ревматоидном артрите, антител к ДНК при системной красной волчанке, а также для доказательства выработки антител к антигенам на лейко- и тромбоцитах. Метод зависит и от многочисленных неспецифических факторов — вот почему особую важность приобретают соответствующие способы контроля. При интерпретации результатов не следует забывать, что общепринятая техника может демонстрировать связывание глобулинов, не всегда обусловленное комплексом антиген-антитело.

Реакция связывания комплемента. Это непрямой метод для выявления антител или антигенов. Реакция основана на том, что комплемент принимает участие в многочисленных реакциях типа антиген-антитело. Постановку опыта осуществляют в два этапа: на I этапе исследуемую сыворотку и известный антиген инкубируют с комплементом, на II — готовят индикаторную систему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов, и добавляют к смеси реагентов. Если I этап опыта завершается реакцией антиген-антитело, то происходит связывание комплемента, при этом гемолиз индикаторных эритроцитов отсутствует или выражен незначительно. Если в исследуемой системе не образуется комплекс антиген-антитело, то комплемент полностью включается в индикаторную систему, что приводит к гемолизу. В качестве источника комплемента обычно служит свежая сыворотка крови морской свинки. Ее комплемент реагирует с антителами всех видов млекопитающих. В индикаторной системе используют, как правило, эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к эритроцитам барана.

РСК — это довольно чувствительный метод, который позволяет выявить антитела в концентрации 0,05 мг/л, его применяют прежде всего при диагностике инфекционных заболеваний (сифилис, вирусные инфекции), а также в ряде случаев для доказательства аутосенсибилизации. Читать подробнее Иммунологические методы с использованием меченых антигенов и антител

Реакция иммунного гемолиза и цитотоксический тест. Иммунный гемолиз может служить доказательством, с одной стороны, активности комплемента, с другой — цитотоксического эффекта антител к эритроцитам, поэтому указанные реакции важны для иммуногематологической диагностики. Пассивную гемагглютинацию можно преобразовать в реакцию пассивного гемолиза, при этом смесь реагентов должна состоять из антител, эритроцитов, нагруженных соответствующим антигеном, и комплемента.

Цитологический тест информативен при изучении патогенетических механизмов. Тем не менее возможности его использования довольно ограничены, учитывая сложность методов клеточного культивирования. Цитотоксические реакции могут быть опосредованы антителами (активация комплемента), клетками-киллерами и сенсибилизированными Т-лимфоцитами.

Тест нейтрализации. Принцип теста состоит в том, что определенные биологические свойства антигена нейтрализуются при воздействии антител. Наиболее широко его применяют для выявления антитоксических (столбняк, дифтерия) и антивирусных антител.

Прочие методы. Кроме методов, ранее описанных в отдельных главах (анафилаксия in vitro по Шульцу-Дейлу, освобождение гистамина из базофильных гранулоцитов и тучных клеток, кожные пробы, «разрешающая» доза аллергена как тест оценки иммунного ответа, пассивная кожная анафилаксия и реакция Прауснитца-Кюстнера), следует назвать способы доказательства продукции IgE, диагностические тесты для анализа иммунных комплексов, методы выявления аутоантител при аутоиммунных заболеваниях.

Читать далее Моноклональные антитела