Методы исследования иммунитета с презентацией

1. Иммунодиагностика

2. Клинико-иммунологические исследования делят:

Клиникоиммунологические
исследования делят:
Методы оценки клеточного иммунитета
Методы оценки гуморального иммунитета
Основные объекты анализа: кровь или сыворотка.

3. Принцип выделения мононуклеарных клеток

4. Цитофлюориметрический метод

5. Цитофлюориметрический метод

6. Цитофлюориметрический метод

7. Цитофлюориметрический метод

8. Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio склеивание) — склеивание корпускул
(бактерий, эритроцитов и др.) антителами в
присутствии электролитов — натрия хлорида.
Прямая
Непрямая

9.

Реакция агглютинации проявляется в виде
хлопьев или осадка, состоящих из корпускул
(например, бактерий), «склеенных»
антителами.
РА используют для:
Определения возбудителя, выделенного от
больного животного
Определения антител в сыворотке крови
больного животного

10. Реакция прямой агглютинации

11. Реакция непрямой агглютинации

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными
на них антигенами взаимодействуют с соответствующими
антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и
выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде
фестончатого осадка.
При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде
пуговки.

12.

Термостабильный АГ
(мелкозернистая
агглютинация)
Термолабильный АГ
(крупнохлопчатая
агглютинация,
протекает быстрее)

13. Реакция преципитации (РП)

это формирование и осаждение комплекса растворимого
молекулярного антигена с антителами в виде помутнения,
называемого преципитатом. Он образуется при смешивании
антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из
них снижает уровень образования иммунного комплекса.

14. Иммуноэлектрофорез

— сочетание метода
электрофореза и
иммунопреципитации:
смесь антигенов
вносится в лунки геля и
разделяется в геле с
помощью
электрофореза, затем
в канавку параллельно
зонам электрофореза
вносят иммунную
сыворотку, антитела
которой
диффундируют в гель и
образуют в месте
«встречи» с антигеном
линии преципитата

15. Реакция связывания комплемента (РСК)

АГ+АТ комплекс
К Fc-фрагментам антител присоединяется комплемент (С),
2 фазы:
1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело
+ комплемент,
2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного
комплемента путем добавления к ней гемолитической
системы.

16. Реакция связывания комплемента (РСК)

Схема РСК с сывороткой
больного
Схема РСК с сывороткой здорового

17. Цитотоксический тест

метод оценки повреждающего действия на культивируемые
клетки каких-либо факторов (физических, химических,
биологических), заключающийся в подсчете доли погибших
клеток после дозированного воздействия повреждающего
фактора.(используется для количественного определения
субпопупяции Т-лимфоцитов)

18. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Различают три разновидности метода прямой,
непрямой, с комплементом.

19. Прямой метод РИФ

основан на том, что антигены
тканей или микробы,
обработанные иммунными
сыворотками с антителами,
меченными флюорохромами,
способны светиться в УФ-лучах
люминесцентного микроскопа.
Бактерии в мазке,
обработанные такой
люминесцирующей сывороткой,
светятся по периферии клетки в
виде каймы зеленого цвета.

20. Непрямой метод РИФ

заключается в выявлении комплекса антиген — антитело с
помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки,
меченной флюорохромом.
В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи
антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот
комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при
прямом методе.

21. Радиоиммунный метод, или анализ (РИА)

высокочувствительный
метод, основанный на
реакции антиген — антитело
с применением антигенов
или антител, меченных
радионуклидом (125J, 14C,
3Н, 51Сr и др.). После их
взаимодействия отделяют
образовавшийся
радиоактивный иммунный
комплекс и определяют
его радиоактивность в
соответствующем счетчике
(бета- или гаммаизлучение). Интенсивность
излучения прямо
пропорциональна
количеству связавшихся
молекул антигена и
антител.

22. Иммунофериентный анализ (ИФА)

выявление антигенов с помощью соответствующих им антител,
конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бетагалактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с
меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют
субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет
продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна
количеству связавшихся молекул антигена и антител
Конкурентный ИФА для
определения антигенов:
искомый антиген(1) и
меченый ферментом
антиген(2) конкурируют
друг с другом за антитела
(3), сорбированные на
твердой фазе.

23. Определение антител в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным антигеном)

24. Определение антигена в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированными диагностическими антителами)

25. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ)

— электронная микроскопия
микробов, чаще вирусов,
обработанных
соответствующими антителами.
Вирусы, обработанные
иммунной сывороткой,
образуют иммунные агрегаты
(микропреципитаты). Вокруг
вирионов образуется «венчик» из
антител, контрастированный
фосфорно-вольфрамовой
кислотой или другими
электроннооптически плотными
препаратами.

26. Иммуноблоттинг (ИБ)

27. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)

Антигенный эритроцитарный диагностикум
Реакция непрямой (пассивной)
агглютинации

28.

Реакция обратной непрямой
гемагглютинации

29. Реакция нейтрализации (РН)

Реакция нейтрализации вирусов в
культуре клеток:
А — цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в
результате размножения вирусов;
Б — ЦПЭ отсутствует в результате
нейтрализации вирусов антителами.

1. НАО «Медицинский университет Астана» Кафедра педиатрии 2

Методы исследования иммунного
статуса и принципы его интерпретации
Выполнила: Ерболсын А. М
Проверила: Кусепова Д. А.
Нур-Султан 2019

2. Иммунный статус

2
Иммунный статус
Иммунный статус — это количественная и
качественная характеристика состояния
функциональной активности органов
иммунной системы и некоторых
неспецифических механизмов
противомикробной защиты.

3.

3
Иммунный статус определяется
эффективностью и согласованностью
работы всех систем и звеньев
иммунитета — макрофагов,
комплемента, цитокинов, Т- и Влимфоцитов, главной системы
гистосовместимости.
• Раздел медицины, изучающий патологию
человека в аспекте нарушений функций
иммунной системы, называется
клинической иммунологией.

4. Исследование иммунного статуса включает в себя:

4
Исследование иммунного статуса
включает в себя:
1) определение группы крови и резус-фактора;
2) общий анализ крови с развернутой
лейкограммой или формулой;
3) определение количества иммуноглобулинов;
4) исследование лимфоцитов;
5) исследование фагоцитарной активности
нейтрофилов.
Для постановки диагноза
иммунопатологического состояния проводят:
сбор иммунологического анамнеза, постановку
клинико-лабораторных, инструментальных и
иммунологических тестов.

5.

5
Сбор анамнеза
При опросе определяют вероятный
иммунопатологический синдром,
основными являются:
— инфекционный синдром;
— аллергический и аутоиммунный
синдромы;
— первичный иммунодефицит;
— вторичный иммунодефицит;
— иммунопролиферативный синдром.

6.

6
— учет возможных индивидуальных
особенностей (возраст, сопутствующие
заболевания) и колебаний показателей
(физиологических и патологическихприем пищи, физические нагрузки, время
суток, действие стрессоров и т.д.);
— учет региональных норм;

7.

7
Общие правила при оценке иммунограмм :
— комплексный анализ, а не оценка одного
показателя;
— анализ в комплексе с клиническими и
анамнестическими данными;
— оценка резких сдвигов показателей (не
менее 20% от нормы);
— анализ в динамике;
— анализ не только (и не столько) абсолютных
данных, а соотношений показателей
(особо- индекс Th/Ts);

8.

8
Петров Р.В. с соавт. создали
двухэтапный
подход к оценке иммунного статуса, в
соответствии с которым иммунологические
тесты разделены на тесты первого и второго
уровня.
На первом этапе с помощью простых
методов выявляют “грубые” дефекты
фагоцитоза, клеточного и гуморального
иммунитета.
К тестам первого уровня относят:
— определение кол-ва лимфоцитов в крови (абс.,
отн.);
— определение кол-ва Т- и В- лимфоцитов;
— определение уровня Ig классов IgG, IgM, IgA;
— определение фагоцитарной активности
лейкоцитов;
— определение титра комплемента.
С учетом анализа результатов определяют
дальнейшую тактику исследования.

9. Лейкоциты

9
Норма – 3,5–8,8 4 109/л. Повышение числа
лейкоцитов – это лейкоцитоз, снижение –
лейкопения. Лейкоцитоз делится на
физиологический и патологический.
физиологического лейкоцитоза могут быть прием
пищи, физическая работа, прием горячих и
холодных ванн, беременность, роды,
предменструальный период.
Патологический лейкоцитоз бывает при
инфекционных заболеваниях (пневмонии,
менингите, общем сепсисе и др.),
инфекционных заболеваниях с поражением
клеток иммунной системы. Но имеются и
исключения. Например, некоторые
инфекционные заболевания протекают с
лейкопенией (брюшной тиф, бруцеллез,

10. Лимфоциты

10
Лимфоциты
Норма: абсолютное содержание – 1,2–3,0 109/л, но
чаще в клиническом анализе крови указывается
процентное содержание лимфоцитов.
Этот показатель составляет 19–37 %.
Лимфоцитоз обнаруживается при хроническом
лимфолейкозе, хронической лучевой болезни,
бронхиальной астме, тиреотоксикозе, некоторых
инфекционных заболеваниях (коклюше, туберкулезе),
при удалении селезенки.
К лимфопении приводят аномалии развития
лимфоидной системы, вирусные инфекции,
ионизирующее излучение, аутоиммунные
заболевания (системная красная волчанка),
эндокринные заболевания (болезнь Кушинга, прием
гормональных препаратов), СПИД.

11. Т-лимфоциты

11
Норма: относительное содержание 50–90 %,
абсолютное – 0,8–2,5 109/л. Количество Тлимфоцитов повышается при аллергических
заболеваниях, в период выздоровления, при
туберкулезе. Снижение содержания Тлимфоцитов происходит при хронических
инфекциях, иммунодефицитах, опухолях,
стрессах, травмах, ожогах, некоторых формах
аллергии, инфаркте.

12. Т-хелперы

12
Норма: относительное содержание – 30–50 %,
абсолютное – 0,6–1,6 109/л. Содержание Тхелперов повышается при инфекциях,
аллергических заболеваниях, аутоиммунных
заболеваниях (ревматоидном артрите и др.).
Снижение содержания Т-хелперов происходит
при иммунодефицитных состояниях, СПИДе,
цито-мегаловирусной инфекции.

13. В-лимфоциты

13
Норма: относительное содержание – 10–30 %,
абсолютное – 0,1–0,9 в 109/л. Повышенное
содержание бывает при инфекциях,
аутоиммунных заболеваниях, аллергиях,
лимфолейкозах.
Снижение количества В-лимфоцитов
обнаруживается при иммунодефицитах,
опухолях.

14. Фагоциты (нейтрофилы)

14
Их активность оценивают с помощью методов,
которые определяют часть клеток, способных
формировать внутри себя фагосому .
Для оценки пищеварительной способности
нейтрофилов используют НСТ-тест (НСТ – это
краситель нитросиний тетразолий).
Норма НСТ-теста – 10–30 %. Фагоцитарная активность
лейкоцитов повышается при острых бактериальных
инфекциях, снижается при врожденных
иммунодефицитах, хронических инфекциях,
аутоиммунных заболеваниях, аллергиях, вирусных
инфекциях, СПИДе.
Активность работы фагоцитов, оценивается так
называемым фагоцитарным числом (в норме клетка
поглощает 5-10 микробных частиц), количеством
активных фагоцитов, индексом завершенности
фагоцитоза (должен быть больше 1,0).

15. Методы исследования лимфоцитов

15
Методы исследования лимфоцитов
Изучение поверхностных CD антигенов
основывается на:
методах розеткообразования;
методе проточной цитометрии;
методах иммунофлюоресценции;
иммуноферментном анализе.
К функциональным тестам относят
методы оценки пролиферативной
активности лимфоцитов на Т- и Вмитогены (РБТЛ- реакция бластной
трансформации лимфоцитов), синтеза
мононуклеарами цитокинов.

16.

16
Для определения количества Т- клеток
используют метод розеткообразования с
эритроцитами барана.
Метод основан на родстве рецептора CD2 с
белками мембраны эритроцитов барана. При
смешивании лимфоцитов с эритроцитами
барана образуются фигуры в виде розеток.
Количество розеткообразующих клеток (ЕРОК) соответствует количеству Т- лимфоцитов
(CD2+ клеток).
Для определения количества В- клеток
используют EAC- розетки. Лимфоциты
смешивают с эритроцитами быка,
обработанными комплементом и антителами
к эритроцитам.
Современный метод – проточная цитометрия.

17.

17
Важнейшее значение имеет
вычисление
иммунорегуляторного индекса
CD4/CD8 (хелперносупрессорного отношения).
CD8+ несут Т- супрессоры и Ткиллеры, часть NK- клеток.
CD4+ несут Т- хелперы и Тиндукторы, моноциты, Т- клетки
ГЗТ.

18.

18

19. Основной принцип иммуноцитометрии:

19
Основной принцип иммуноцитометрии:
Меченная флюоресцентными
МКА исследуемая клетка
проходит с потоком жидкости
по капилляру.
Поток пересекается лучом
лазера. Прибор фиксирует
отраженный от поверхности
клетки сигнал по принципу
«да/нет».
По изменению проходящей
лазерной волны определяются
параметры и размеры клетки
(прямое и боковое
светорассеивание).
Лазерный луч индуцирует
флюоресценцию МКА на
поверхности клеток, что дает
информацию о наличии
определенных рецепторных
структур.
В результате суммирования
информации по всей
популяции клеток прибор
выдает точный количественный
и качественный анализ
состояния клеточных популяций.

20.

20
Стандартная
панель МКА позволяет
определять следующие СД-маркеры: СД3 (Тклетки), СД4 (Т-хелперы), СД8 (Тцитотоксические), СД20 (В-клетки), СД16 (NKклетки), СД14 (моноциты/макрофаги), СД25
(рецептор ИЛ-2).

21.

21
Методы исследования главных компонентов
иммунной системы принято делить также на
скрининговые и развернутые.
При оценке В- системы иммунитета к
скрининговым тестам относят определение колва CD19+ и CD20+ клеток, IgG, IgM и IgA, к
развернутым — бласттрансформацию (РБТЛ) на
митоген лаконоса и S.aureus, поверхностных
маркеров В- лимфоцитов.

22. Иммуноглобулины Jg

22
Иммуноглобулины Jg
Иммуноглобулин А. Норма: 0,6–4,5 г/л.
JgА повышается при острых инфекциях, аутоиммунных
заболеваниях (чаще в легких или в кишечнике),
нефропатиях. Снижение JgА бывает при хронических
заболеваниях (особенно дыхательной системы и
желудочно-кишечного тракта), гнойных процессах,
туберкулезе, опухоли, иммунодефицитах.
Иммуноглобулин Е. Норма: 0-0,38 мг/л. Повышается
количество JgЕ при наследственно обусловленных
аллергических реакциях, аллергических поражениях
органов дыхания грибком Аспергиллусом, глистной
инвазии
Снижение JgЕ происходит при хронических инфекциях,
приеме лекарств, которые угнетают деление клеток,
врожденных иммунодефицитных заболеваниях.

23.

23
Иммуноглобулин М. Норма: 0,6–3,4 г/л.
Содержание JgМ повышается при бронхиальной
астме, инфекциях (острых и хронических), при
обострениях, аутоиммунных заболеваниях
(особенно при ревматоидном артрите).
Понижается JgМ при первичных и вторичных
иммунодефицитах.
Иммуноглобулин G. Норма: 6,0-17,6 г/л.
Количество JgG повышается в крови при
аллергиях, аутоиммунных заболеваниях,
перенесенных в прошлом инфекциях. Снижение
содержания JgG происходит при первичных и
вторичных иммунодефицитах.

24.

Тесты второго уровня – более глубокий
анализ состояния иммунной
24
системы проводят с помощью аналитических методов:
методы оценки функциональной активности Т- и В- лимфоцитов,
фагоцитов, вспомогательных клеток, естественных киллеров,
компонентов системы комплемента и др.
• тесты иммунофенотипирования для определения относительного
и абсолютного количества популяций и субпопуляций Т-, В-, NKлимфоцитов;
• активационные маркеры лимфоцитов;
• оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата
фагоцитарных клеток;
• определение основных классов и подклассов иммуноглобулинов;
• циркулирующие иммунные комплексы;
• определение концентрации компонентов комплемента в
сыворотке крови (С3, С4, С5, С1-ингибитор);
• функциональная активность различных субпопуляций лимфоцитов;
• оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов;
• исследование интерферонового статуса;
• кожные пробы и т.д.

25.

25
Все выше перечисленные нормы показателей
иммунного статуса могут несколько отличаться в
разных иммунологических лабораториях. Это
зависит от методики диагностики и используемых
реактивов. Но иммунная система, как и любая
другая система организма, может иметь
расстройства в любых звеньях. Так возникают
иммунодефициты.

26.

26
Следует особо подчеркнуть, что полноценный анализ
иммунограммы возможен только в комплексе с
клиническим состоянием и анамнезом пациента.
Отсутствие характерных сдвигов в иммунограмме
при выраженных клинических симптомах следует
считать атипичной реакцией иммунной системы, что
является отягощающим признаком заболевания.
Полученные данные пациента сравниваются со
средними значениями для данного аналита,
полученными в регионе проживания пациента.
Среднестатистические показатели различаются в
зависимости от региона и подчиняются
климатогеографическим условиям, экологической
обстановке, условиям жизни.
Необходимо также учитывать возраст пациента и
циркадные ритмы.