Методы изучения клеточного иммунитета
Исследование поверхностных антигенов T-лимфоцитовОпределение поверхностных антигенов T-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии позволяет изучить их созревание, дифференцировку и активацию.
Стимуляция T-лимфоцитов in vitroНарушения созревания и дифференцировки T-лимфоцитов при иммунодефицитах с недостаточностью клеточного иммунитета происходят на разных уровнях. Так, при тяжелом комбинированном иммунодефиците нарушается созревание T-лимфоцитов в тимусе, что проявляется отсутствием на поверхности T-лимфоцитов антигена CD2. При этом заболевании также возможны отсутствие CD3, CD4 и неспособность T-лимфоцитов синтезировать цитокины. При синдроме обнаженных лимфоцитов на мембране активированных T-лимфоцитов отсутствуют антигены MHC класса II. При синдроме Вискотта—Олдрича снижена экспрессия антигена CD43, участвующего в активации T-лимфоцитов. Тяжелые иммунодефициты с недостаточностью клеточного иммунитета сопровождаются выраженным нарушением функции T-лимфоцитов, хотя абсолютное и относительное число этих клеток может быть нормальным.
Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) Под действием митогенов, антигенов и аллогенных клеток покоящиеся T-лимфоциты активируются, превращаются в бластные клетки и начинают делиться. Спонтанная пролиферация лимфоцитов (бласттрансформация) бывает повышена у больных, перенесших многократные переливания крови, больных аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, при бактериальных и вирусных инфекциях, а также у новорожденных.
Смешанную культуру лимфоцитовприменяют для оценки способности T-лимфоцитов распознавать антигены HLA аллогенных B-лимфоцитов и моноцитов. Стимулирующие клетки (аллогенные B-лимфоциты) инактивируют облучением или митомицином. Реакция лимфоцитов больного оценивается по включению в ДНК меченого тимидина.
Биохимические исследования При подозрении на комбинированную недостаточность гуморального и клеточного иммунитета определяют активность аденозиндезаминазы и пуриннуклеозидфосфорилазы (участвуют в метаболизме нуклеозидов). При атаксии-телеангиэктазии почти всегда повышен уровень альфа-фетопротеина в сыворотке, что позволяет дифференцировать это заболевание с другими нервными болезнями. К редким метаболическим нарушениям, сопровождающимся недостаточностью клеточного иммунитета, относятся оротовая ацидурия и биотин-зависимая недостаточность карбоксилаз (проявляется алопецией и неврологическими нарушениями). При недостаточности транскобаламина II (участвует в транспорте витамина B12) поражаются быстрообновляющиеся ткани, поэтому для этого заболевания характерны недостаточность гуморального иммунитета, нарушения кроветворения (анемия, тромбоцитопения), понос и отставание в развитии.
Генетические исследованияУ больных с тяжелой недостаточностью клеточного иммунитета возможен химеризм (существование клеток разных генотипов в одном организме). Он возникает при попадании материнских клеток крови в кровь плода, переливании компонентов крови и трансплантации костного мозга. Если в крови больного содержатся клетки человека противоположного пола, химеризм легко выявить, обнаружив клетки с женским и мужским кариотипами. В остальных случаях проводят типирование клеток крови больного по HLA. Это исследование также позволяет выявить отсутствие антигенов HLA класса II на активированных T-лимфоцитах при синдроме обнаженных лимфоцитов.
Сканирующая электронная микроскопия выявляет T-лимфоциты, на поверхности которых нет микроворсинок, что характерно для синдрома Вискотта—Олдрича.
Биопсия тимусапроизводится в ряде случаев для подтверждения диагноза тяжелого комбинированного иммунодефицита. При недостаточности клеточного иммунитета в тимусе определяются скопления ретикулоэпителиальных клеток, отсутствие телец Гассаля и четкой границы между корковым и мозговым веществом, резкое снижение числа тимоцитов.
Биопсия лимфоузловПри недостаточности клеточного иммунитета в биоптате лимфоузла выявляется опустошение паракортикальной зоны. Из-за риска раневой инфекции и осложнений анестезии биопсию лимфоузлов проводят только в том случае, когда другие лабораторные исследования не позволяют подтвердить диагноз.
Исследование фагоцитозапоказано при хронических и рецидивирующих бактериальных инфекциях, если исследование гуморального и клеточного иммунитета не выявило отклонений от нормы. Недостаточность фагоцитов может быть обусловлена нарушением миграции, хемотаксиса, адгезии фагоцитов, а также нарушением собственно фагоцитоза. Кроме того, недостаточность фагоцитов может быть обусловлена дефицитом опсонинов (антител и комплемента) и нарушением метаболизма фагоцитов.
Тест восстановления нитросинего тетразолияприменяется в диагностике хронической гранулематозной болезни. Суть метода заключается в следующем: к фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, в норме при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. О нарушении метаболизма фагоцитов судят по снижению интенсивности синего окрашивания. При выявлении нарушений определяют уровень цитохрома b558 и других белков фагоцитов.
Хемилюминесценция также позволяет оценить функциональную активность фагоцитов. В норме при фагоцитозе появляется большое количество свободных радикалов кислорода, окисляющих субстрат, например компоненты клеточной стенки бактерий. Окисление сопровождается излучением видимого или ультрафиолетового света. По интенсивности излучения можно судить о функциональной активности фагоцитов.
Оценка фагоцитарной активности — наиболее информативный способ исследования опсонинов и функционального состояния фагоцитов. В норме в течение 2 ч фагоцитами поглощается и разрушается около 95% бактерий. При хронической гранулематозной болезни число разрушенных бактерий не превышает 10%, а внутри лейкоцитов обнаруживаются жизнеспособные бактерии. Присутствие живых бактерий в лейкоцитах при инкубации с сывороткой здорового свидетельствует о нарушении переваривания бактерий в отсутствие снижения способности к захвату бактерий. Повышенное содержание жизнеспособных бактерий в надосадочной жидкости при инкубации с сывороткой больного свидетельствует о дефиците опсонинов.
Хемотаксис лейкоцитов Нарушение хемотаксиса может быть обусловлено дефектом фагоцитов, наличием ингибиторов хемотаксиса, дефицитом сывороточных или тканевых факторов хемотаксиса.
Для исследования хемотаксиса лейкоцитов применяютметод кожного окна. Исследование хемотаксиса in vitro основано на стимуляции выделенных из крови фагоцитов факторами хемотаксиса. Способность фагоцитов к направленной миграции можно оценить, поместив их в камеру Бойдена или чашку Петри с агарозой.
Адгезия лейкоцитовНарушение адгезии лейкоцитов обусловлено снижением экспрессии или отсутствием на их поверхности молекул адгезии, например CD11/CD18. Для определения молекул адгезии применяют проточную цитофлюориметрию. Отсутствие CD11/CD18 на нейтрофилах и моноцитах проявляется поздним отпадением пуповины, рецидивирующими бактериальными инфекциями, пародонтитом.
Диагностика асплении.Селезенка играет важную роль в защите от инфекции, так как содержит огромное количество макрофагов и плазматических клеток. У больных с аспленией часто наблюдается сепсис, в мазках крови выявляются деформированные эритроциты и тельца Говелла—Жолли. Асплению выявляют с помощью ультрасонографии.
Другие исследования.Определение активности миелопероксидазы, глутатионпероксидазы, лизоцима, Г-6-ФД, пируваткиназы и электронную микроскопию проводят для выявления незначительных нарушений функций фагоцитов и в научных целях. При нейтропении показаны повторные определения числа лейкоцитов в крови, определение числа лейкоцитов в крови после введения кортикостероидов, адреналина и эндотоксина, определение антител к лейкоцитам, исследование костного мозга.
Исследование костного мозгапроводят при стойкой лейкопении или лейкоцитозе, изменении морфологии лейкоцитов, выявлении бластных форм в крови.
Исследование комплементаЕсли данные анамнеза и основных лабораторных исследований указывают на недостаточность комплемента, показано его углубленное исследование. Оно включает количественное определение и функциональную оценку компонентов комплемента, исследование альтернативного пути активации комплемента, определение опсонинов и факторов хемотаксиса в сыворотке. О дефиците опсонинов в исследуемой сыворотке свидетельствует ее неспособность усиливать фагоцитоз бактерий и дрожжевых грибов нормальными лейкоцитами.
Пренатальная диагностика и генетическое консультированиеНа сегодняшний день установлено, что многие иммунодефициты являются наследственными заболеваниями: известен тип их наследования, выявлена локализация дефектного гена, определен продукт этого гена (табл. 2). В настоящее время стало возможным выявление носительства дефектного гена. Так, гетерозиготное носительство дефектного гена, кодирующего какой-либо фермент, можно выявить по снижению активности этого фермента, например при аутосомно-рецессивном тяжелом комбинированном иммунодефиците снижена активность аденозиндезаминазы, при хронической гранулематозной болезни — ферментов дыхательной цепи, при X-сцепленной агаммаглобулинемии — тирозинкиназы в B-лимфоцитах. Выявлен также целый ряд дефектов, не связанных с нарушением синтеза ферментов, например при X-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците — нарушен синтез гамма-цепи рецептора к интерлейкину-2, синдроме гиперпродукции IgM — синтез гликопротеида клеточной мембраны gp39 — лиганда рецептора CD40 B-лимфоцитов. У девочек с X-сцепленными иммунодефицитами, проявляющимися нарушением дифференцировки лимфоцитов (X-сцепленная агаммаглобулинемия, X-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит, синдром Вискотта—Олдрича), в крови выявляются как дифференцированные, так и недифференцированные лимфоциты. Это обусловлено тем, что X-хромосома, несущая дефектный ген, инактивирована лишь в части клеток. Наличие недифференцированных лимфоцитов в отсутствие клинических проявлений этих иммунодефицитов указывает на носительство дефектного гена. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов также позволяет выявить носителей дефектного гена в семье.
Лабораторные методы пренатальной диагностики основаны на исследовании клеток пуповинной крови и околоплодных вод, а также ворсин хориона. Так, при всех формах тяжелого комбинированного иммунодефицита в пуповинной крови отсутствуют T-лимфоциты, при синдроме Вискотта—Олдрича обнаруживаются тромбоцитопения и T-лимфоциты, лишенные микроворсинок. В табл. 2 указан тип наследования и возможность применения генетических методов для диагностики некоторых первичных иммунодефицитов.
Источник
Содержание
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА
Назначение иммунограммы пациенту означает,
что лечащий врач, а в идеальном случае врач-иммунолог, предполагает наличие
нарушений в иммунной системе. Повторяющиеся бактериальные, вирусные и грибковые
инфекции, аллергические проявления, возникновение системных заболеваний говорят
о существовании этих нарушений. Выделяют три основных группы патологий иммунной
системы (Б. В. Пинегин, 1997):
• количественная или функциональная недостаточность
того или иного звена иммунитета, что ведет к развитию иммунодефицитного состояния;
• нарушение в распознавании антигена
иммунной системой, что ведет к развитию аутоиммунных процессов;
• гиперреактивный или “извращенный” иммунный
ответ, проявляющийся в развитии аллергических заболеваний.
Все методы иммунодиагностики можно разделить
на скрининговые и уточняющие. Первые существуют для фиксирования нарушений в
иммунной системе, вторые — для установления механизмов, задействованных в их
реализации с целью дальнейшей иммунокоррекции.
Т-клеточная система
иммунитета
Скрининговые методы:
- определение общего
числа лимфоцитов; - определение процентного и абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов — CD3(+)
и двух основных субпопуляций — хелперов CD4(+) и киллеров/супрессоров CD8(+)
(необходимо при этом обращать внимание на количество “двойных негативов” —
CD3(+)CD4(-)CD8(-) и “двойных позитивов” — CD3(+)CD4(+)CD8(+); - исследование ответа Т-лимфоцитов на ФГА в реакции бластной трансформации
(РБТЛ).
Уточняющие методы:
- определение “активационных
маркеров” CD25 и HLAII на Т-лимфоцитах; - исследование продукции цитокинов — гамма-интерферона, интерлейкина-2,
-4, фактора некроза опухоли, интерлейкина-6 in vivo и in vitro; - изучение пролиферативного ответа в РБТЛ
на специфический антиген; - исследование процессов апоптоза Т-лимфоцитов методом определения CD95.
В- клеточная система иммунитета
Скрининговые методы
- определение процента
и абсолютного количества В-лимфоцитов — CD20(+) или CD19(+); - определение уровней неспецифических иммуноглобулинов A,M,G,E в сыворотке
крови; - определение циркулирующих в крови иммунных комплексов;
- исследование ответа в РБТЛ на В-клеточный митоген.
Уточняющие методы
- определение специфических
иммуноглобулинов A,M,G,E в сыворотке крови; - определение продукции ИЛ-6 in vivo и in vitro;
- определение секреторного IgA.
Система фагоцитов (нейтрофилов)
Скрининговые методы
- оценка абсолютного
числа нейтрофилов; - исследование интенсивности поглощения микробов фагоцитами (процент клеток-фагоцитов
и средняя способность к поглощению каждого фагоцита); - бактерицидность фагоцитов по НСТ тесту.
Уточняющие тесты
- интенсивность хемотаксиса
(миграции) фагоцитов; - исследование адгезионной способности нейтрофилов к пластику и оценка
числа клеток с адгезионными молекулами CD11/CD18 на мембране.
Далее представлен бланк расширенной иммунограммы, учитывающей
скрининговые и уточняющие методы исследования иммунитета. В ней представлены нормы
по каждому блоку исследований.
Карта исследования иммунного статуса
I. Паспортные данные
П. Диагноз
Ш. Спецанамнез
IV. Параметры клеточного
иммунитета
Количество лимфоцитов | |||
Относительное (%) | Абсолютное в мм3 | ||
1. Общие лейкоциты 2. Лимфоциты 3. CD3 (Т-лимфоцит) 4. CD4 (Т-хелперы) 5. CD8 (Т-киллеры) | N 28-39 N 50-76 N 31-46 N 26-40 | N 4,0-8,0xl000 N l,6-2,4xl000 N 800-1216 N 500-900 N 416-640 | |
6.Соотношение CD4/CD8 | N 1,0-1,5 | ||
7. CD16 (NK- клетки) 8. CD20 (B-лимфоциты) 9. CD25 (Рецептор ИЛ-2) 10. HLA II | N 9-16 N 11-16 N 13-24 N 19-30 | N 170-400 N 200-400 N 208-576 N 340-720 | |
11.CD95 | N 5-7 | N 90-112 |
V. Параметры цитокинового звена
иммунитета
Продукция цитокинов
Спонтанная | Индуцированная | В сыворотке крови | |
1. ИФН-альфа (пг/мл) | N 30-50 | N 1000-5000 | N 0-50 |
2. ИЛ-1 бета (пг/мл) | N 30-50 | N 1000-5000 | N 0-50 |
3. ИЛ-2 (ед/мл) | N 0-0,5 | N 10-25 | |
4. ИЛ-4 (пг/мл) | N 30-50 | N 1000-5000 | N 0-50 |
5. ИЛ-6(ед/мл) | N 30-50 | N 1000-3000 | N 0-50 |
6. ИЛ-8 (пг/мл) | N30-100 | N 1000-5000 | N 0-50 |
7. ФНО- а(пг/мл) | N30-50 | N 500-3000 | N 0-50 |
VI. Параметры гуморального звена иммунитета.
Иммуноглобулины сыворотки
IgM (мг/мл) | N 0,5-1,9 |
IgG (мг/мл) | N 8-16 |
IgA (мг/мл) | N 1,4-4,2 |
IgE (KE/л) | N 20-100 |
Система комплемента | Содержание компонентов |
Clq | N 100-250 |
СЗ | N 700-1800 |
С3а | N 0,05-0,15 |
С4 | N 200-500 |
С5а | N 0,01-0,03 |
C l inh | N 150-350 |
VII. Система нейтрофильных гранулоцитов
FMLP | ИЛ-8 | |
Миграция (индексы миграции) | N 2,6-2,8 | N 1,7-3 |
спонтанная | индуцированная | индекс стимуляции | |||
Бактерицидность (НСТ-тест, ед/млн. | N 70-120 | N 150-200 | N 1,2-2 | ||
Адгезия(%) | N 40-55 | N 70-80 | |||
Фагоцитоз (%) | N 48-88 | ||||
Индекс фагоцитоза | N 1,3-3 |
VIII. Функциональная
активность лимфоцитов
ФГА | PWM | |
РБТЛ (индекс стимуляции) | N 20-100 | N 5-20 |
IX. Система HLA
HLA-A HLA-С
HLA-В HLA-DR
X. ЦИК (Циркулирующие
иммунные комплексы)
Еще об этом см. кратко
Сайт создан в системе uCoz
Источник
План
Введение
1.Т-лимфоциты
1.1.Созревание и дифференцировка.
1.2. Позитивная и негативная селекция.
1.3. .Распределение Т-клеток по лимфоидным органам.
2.Т-клеточный рецептор
3.Процессы активации Т-лимфоцитов: двусигнальная модель
4.Регуляторные Т-клетки. Виды, маркеры, развитие, свойства, функции.
5.Экспериментальные модели дефекта Т-лимфоцитов
6.Методыизоляции субпопуляций Т-лимфоцитов.
6.1Разделение клеток на стеклянных гранулах.
6.2Фракционирование клеток на найлоновых волокнах.
6.3Электрофорез клеток.
6.4Сортировка клеток.
6.5Разделение на монослое.
7.Методы изучения Т-клеток.
7.1Методы, основанные на изучении поверхностных маркеров
7.2.Исследование функционального состояния лимфоцитовЗаключение
Список литературы
Введение
Основу клеточного иммунитета составляют лимфоциты, которые для своего созревания переселяются из костного мозга в другой центральный орган лимфоидной системы — тимус (вилочковая железа). Эта ветвь лимфоцитов получила название тимус-зависимые, или Т-лимфоциты.
В организме человека Т-лимфоциты многократно покидают лимфоидные органы, попадая сначала в лимфу, затем вкровь, а из крови снова возвращаются в органы. За свою жизнь лимфоцит может проходить более 100 километров. Благодаря интенсивной циркуляции, лимфоциты, когда в них возникает потребность, быстро появляются в «горячих точках».
В тимусе формируются разные виды Т-клеток. Одни из них участвуют в регуляции развития В-клеток и образования антител, другие взаимодействуют с фагоцитами, помогая им разрушатьпоглощенные микробные клетки. Некоторые Т-лимфоциты обладают способностью разрушать клетки, содержащие чужеродный антиген, их назвали цитотоксическими или «киллерами».
Другая разновидность лимфоцитов — Т-хелперы — первыми распознают чужеродные вещества. Т-хелперы не способны вырабатывать антитела и убивать клетки-мишени, но, распознавая чужеродный антиген, они реагируют на него выработкой различныхфакторов, которые необходимы для размножения и созревания В-клеток и Т-киллеров.
Существуют еще Т-супрессоры, которые подавляют активность иммунного ответа, когда необходимость в нем отпадает. Если иммунные клетки будут продолжать работать, то будут поражаться собственные здоровые клетки организма, что приведет к развитию различных болезней (их называют аутоиммунными).
Т-лимфоциты способны выполнятьсвои функции только при определенных условиях и поддержке других клеток, таких как В-лимфоциты и различные фагоцитирующие клетки, в первую очередь макрофаги — большие по размерам клетки, поглощающие и переваривающие микробы и другие погибшие клетки. Существенную роль в работе иммунной системы играют так называемые дендритные (ветвистые) клетки, часть которых находится непосредственно под кожей ислизистой оболочкой человека. Такие клетки (антигенпредставляющие) захватывают микробы и вирусы, проникающие через слизистую, а затем переносят в лимфоузлы, где «представляют» их В- и Т- лимфоцитам, которые их атакуют.
Полностью разделить клеточный иммунитет и гуморальный невозможно: в инициации образования антител участвуют клетки, а в некоторых реакциях клеточного иммунитета важную связующую функциювыполняют антитела.
Более того, не существует, по-видимому, клеточного иммунитета без образования антител, которые способны различными путями модифицировать опосредованный клетками иммунный ответ. Вообще, при скоординированном иммунном ответе происходит многосторонний обмен сигналами между различными типами вступающих в него лейкоцитов и тканевыми клетками.
1.Т-лимфоциты
1.1Созревание идифференцировка
Развитие Т-клеток в тимусе происходит под непосредственным влиянием и в результате прямых контактов тимоцитов со стромальными эпителиоцитами, клетками-кормилицами, макрофагами тимуса, а также под влиянием гормонов тимуса (α1-,β1-,β4-тимозина, тимопоэтина, тимического гуморального фактора, тимостимулина. Под влиянием гормонов тимуса протекают процессы…
Источник