Методы определения клеточного и гуморального иммунитета
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) представляют собой комплексы, состоящие из антител, антигена и компонентов комплемента. Образование ЦИК – нормальный механизм защиты организма, но иногда, вследствие избыточного накопления, ЦИК сохраняются в течение длительного времени и откладываются в различных тканях и органах, приводя к их поражению (при системной красной волчанке (СКВ)).
Уровень ЦИК в крови – показатель развития различных воспалительных процессов в организме и показатель активности течения аутоиммунных заболеваний.
Показания
· диагностика и наблюдение за течением аутоиммунных и ревматоидных заболеваний (диффузных болезней соединительной ткани, системных васкулитов. СКВ, болезни Крона, аутоиммунного гепатита, коллагенозов и др.);
· диагностика и наблюдение за течением хронических инфекционных заболеваний (ВИЧ-инфекции, подострого инфекционного эндокардита и др. вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний);
· наблюдение за течением хронических воспалительных заболеваний почек (гломерулонефрита);
· в комплексе с другими исследованиями для диагностики иммунодефицитных состояний (входит в исследование иммунного статуса)
Методика
Определение ЦИК в сыворотке крови осуществляется методом иммунного турбидиметрического анализа.
С3 и С4-компоненты комлемента
Белки компонента комплемена синтезируются в печени и в норме присутствуют в плазме в неактивной форме. Пусковыми механизмами активации системы комплемента является проникновение в организм бактерий и вирусов, грибов, простейших.
Показания:
диагностика болезней иммунных комплексов — системная красная волчанка (СКВ), генерализованные васкулиты, гломерулонефрит, энтеропатии (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит), аутоиммунная гемолитическая анемия.
При рецидивирующих инфекциях: стрептококковом и стафилококковом сепсисе, бактериальных и вирусных менингитах, паразитарных инвазиях.
Мониторинг лечения болезней иммунных комплексов— СКВ, аутоиммунный тиреоидит, ювенильный дерматомиозит.
Диагностика наследственного дефицита компонентов комплемента -ангионевротический отек или болезнь Квинке, дефицит С3 при рекуррентных инфекциях, дефицит С4 при СКВ.
Методика
Определение С3 и С4 – компонентов комплемента осуществляется турбодиметрическим методом на биохимическом анализаторе «АRCHITECT с8000»
Иммунный статус (субпопуляционное определение абсолютного и относительного количества лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, естественных киллеров CD16+, общих IgA, IgM, IgG, ЦИК, подсчет ИРИ)
Для оценки клеточного иммунитета определяются его основные параметры (относительное содержание клеток в крови): зрелые Т-клетки, Т-хелперы, Т-супрессоры /цитотоксические, В-клетки, NK-клетки (естественные киллеры) и иммуно-регуляторный индекс (ИРИ) – соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров/цитотоксических.
Показания
· выявление первичного и вторичного иммунодефицита,
· контроль за проведением иммуностимулирующей терапии.
Методика
Определение основных параметров клеточного иммунитета проводится методом проточной цитометрии с использованием реагентов «Лаборатория КОНСТАНТА» на проточном цитометре «Partec CyFlow».
Кроме показателей клеточного иммунитета, в иммунный статус входят показатели гуморального иммунитета: общие IgA, IgM, IgG, и ЦИК.
Подготовка
Взятие крови предпочтительно проводить утром натощак, после 8 – 14 часов ночного периода голодания (воду пить можно), допустимо днем через 4 часа после легкого приема пищи. Накануне исследования необходимо исключить психоэмоциональные и физические нагрузки (спортивные тренировки), прием алкоголя, за час до исследования – курение. Отказаться от приема лекарственных препаратов: даназол, гидралазин, фенитоин, антибактериальных препаратов пенициллинового ряда, метилдопа, цимстидин, пероральные контрацептивы.
Количественное содержание иммуноглобулинов (IgА, IgМ, IgG) является основным показателем гуморального иммунного ответа и необходимо для оценки функциональной полноценности иммунной системы и диагностики патологических нарушений ее работы.
Определение уровня иммуноглобулинов является важным при диагностическом и клиническом мониторинге первичных иммунодефицитов, моноклональных гаммапатий, аутоиммунных заболеваний и других патологических состояний (Х-сцепленной агаммаглобулинемии, гипер-IgM, селективном IgА-дефиците, дефиците субклассов IgG, транзиторной гипогаммаглобулинемии новорожденных и др.). При первичных иммунодефицитах определение иммуноглобулинов имеет решающее диагностическое значение.
Снижение концентрации может свидетельствовать о различных патологиях – от генетических дефектов синтеза иммуноглобулинов до транзиторных состояний, связанных с потерей белка организмом. Причинами снижение синтеза иммуноглобулинов могут быть: моноклональные гаммапатии, термические ожоги, злокачественные лимфомы, плазмоцитомы, карциномы, болезни Ходжкина, заболеванияпочек, первичные и вторичные иммунодефициты.
При первичном контакте с антигеном сначала синтезируются IgM, затем IgG. При повторном – IgG синтезируются быстрее и в большем количестве. IgА нейтрализует вирусы и бактериальные токсины. Повышение концентраций говорит о наличии аллергических, аутоиммунных процессов, характерно для инфекционных заболеваний. Увеличение Ig разных классов отмечают при различных патологических ситуациях. Концентрация IgM возрастает в острый период и при обострении хронической инфекции, IgG – в стадии разрешения или формирования хронической инфекции, IgА – при некоторых вирусных инфекциях.
Метод исследования: >ИФА, иммунотурбидиметрия, иммунонефелометрия.
Условия взятия и хранения образца: Сыворотка крови. Хранение не более 24 ч при 4–8 °С. Допускается однократное замораживание образца.
Система комплемента
Система комплемента – комплекс белков, постоянно присутствующих в крови. Это каскадная система протеолитических ферментов, способных лизировать клетки, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов, участвует в реализации иммунного ответа организма. Является важным компонентом как врожденного, так и приобретенного иммунитета.
Она активизируется реакцией антиген-антитело и необходима для опосредованного антителами иммунного гемолиза и бактериолиза, играет важную роль при фагоцитозе, опсонизации, хемотаксисе и иммунном гемолизе и необходима для усиления эффекта взаимодействия между специфическими антителами и антигеном.
Одной из причин снижения факторов комплемента в сыворотке крови могут являться аутоантитела, направленные против факторов комплемента. Снижение С3 и С4 компонентов комплемента сопровождается клинической картиной рецидивирующего кожного геморрагического васкулита и артралгией.
Уровень компонентов комплемента в крови варьирует в широких пределах. Наследственный дефицит компонентов комплемента или их ингибиторов может приводить к аутоиммунным нарушениям, повторным бактериальным инфекциям, хроническим воспалительным состояниям.
С3-компонент комплемента – центральный компонент системы, белок острой фазы воспаления. Это важнейшая часть защитной системы против инфекций. Он образуется в печени, макрофагах, фибробластах, лимфоидной ткани и коже. Вследствие активации С3 выделяется гистамин из тучных клеток и тромбоцитов, хемотаксис лейкоцитов и соединение антител с антигеном, поддерживается фагоцитоз, усиливается проницаемость стенок сосудов и сокращение гладкой мускулатуры. Активация С3 играет важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний.
С4-компонент комплемента – гликопротеин, синтезируется в легких и в костной ткани. С4 поддерживает фагоцитоз, увеличивает проницаемость стенки сосудов, участвует в нейтрализации вирусов. Он участвует только в классическом пути активации системы комплемента. Увеличение или уменьшение содержания комплемента в организме наблюдается при многих заболеваниях.
Показания к исследованию
- Подозрение на врожденный дефицит комплемента, аутоиммунные заболевания, острые и хронические бактериальные и вирусные инфекции, (особенно рецидивирующие), онкологические заболевания;
- динамическое наблюдение больных с системными аутоиммунными заболеваниями.
Условия взятия и хранения образца: Сыворотка крови. Хранение не более 24 ч при 4–8 °С. Допускается однократное замораживание образца.
Метод исследования: ИФА, иммунотурбидиметрия, иммунонефелометрия.
Повышение концентрации С3 наблюдается при некоторых острых бактериальных, паразитарных и вирусных инфекциях, аутоиммунных и воспалительных заболеваниях.
Снижение концентрации С3 -наблюдается при врожденных дефектах комплемента, различных воспалительных и инфекционных, аутоиммунных заболеваниях, длительном голодании, при лечении цитостатиками, ионизирующем излучении.
Повышение концентрации С4 характерно для реакции острой фазы, отмечается при аутоиммунных заболеваниях, назначении некоторых лекарственных препаратов.
Снижение концентрации С4 – отмечается при врожденных дефектах системы комплемента (С4 дефицит новорожденных), некоторых аутоиммунных заболеваниях, системных васкулитах, синдроме Шегрена, трансплантации почек.
Циркулирующие иммунные комплексы
ЦИК в крови – показатель развития различных воспалительных процессов в организме и активности их течения. Повышение ЦИК наблюдается при острых и хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, вирусных гепатитах. ЦИК присутствуют у многих людей, страдающих СКВ и РА, особенно в тех случаях, когда есть осложнения в виде васкулитов. Существует положительная корреляция между активностью заболевания и уровнем ЦИК в крови. Формирование ЦИК представляет собой физиологический механизм защиты, приводящий к быстрому устранению либо эндогенных, либо экзогенных антигенов через ретикуло-эндотелиальную систему. Однако ЦИК обладают способностью связывать и активировать комплемент, что ведет к повреждению ткани. Выходя из кровотока в мелких сосудах, они могут откладываться в тканях, в гломерулах почек, в легких, коже, суставах, стенках сосудов. Клинически это часто проявляется гломерулонефритами, артритами, нейтропениями. Патологические реакции на иммунные комплексы могут быть обусловлены превышением скорости их образования над скоростью элиминации, дефицитом одного или нескольких компонентов комплемента или функциональными дефектами фагоцитарной системы. Высокий уровень ЦИК в сыворотке крови и/или в других биологических жидкостях наблюдается при многих воспалительных и злокачественных заболеваниях, что может стать причиной развития патологии. Определение ЦИК в сыворотке крови – важный маркер для оценки активности заболевания, особенно при аутоиммунных заболеваниях. Снижение концентрации ЦИК в течение заболевания или при лечении свидетельствует об угасании воспалительного процесса и эффективности терапии.
Методы исследования: Для определения ЦИК в сыворотке крови человека используют метод иммунонефелометрии и иммунотурбодиметрии.
Условия взятия и хранения образца: Сыворотка крови. Образец стабилен, не более 24 ч при 4–8 °С. Допускается однократное замораживание образца.
Показания к исследованию: Оценка и мониторинг активности аутоиммунных, аллергических и инфекционных заболеваний.
Повышенные значения
- Аутоиммунные заболевания;
- иммунокомплексные заболевания;
- острые бактериальные, вирусные, паразитарные, грибковые заболевания;
- сывороточная болезнь;
- коллагенозы;
- ревматизм;
- аллергические альвеолиты, васкулиты, феномен Артюса;
- гломерулонефрит;
- бронхиальная астма;
- миокардит.
. Иммунный статус. Влияние климато-географических,
социальных, экологических и медицинских факторов. Оценка иммунного статуса,
определение состояния гуморального и клеточного иммунитета. Основные показатели
и методы их определения.
Состояние функциональной активности иммунной системы
человека в целом имеет жизненно важное значение для организма и обозначается
понятием «иммунный статус».
Иммунный
статус это количественная и
качественная характеристика состояния функциональной активности органов
иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов про-тивомикробной
защиты.
Влияние
факторов
Среди
климато-географических факторов на иммунный статус оказывают влияние
температура,влажность, солнечная радиация, длина светового дня и т.д.Например:
фагоцитарная активность и кожные аллергические пробы менее выражены у жителей
северных районов, чем у южан.Вирус Эпштейна Барр у людей белой расы вызывает
инфекционное заболевание-мононуклеоз а у лиц негроидной расы онкопатологию и
т.д.Жители Африки менее подвержены заб дифтерии чем европейское население.
К
социальным факторам относятся питание, жилищно-бытовые условия,
профессиональные вредности и т.д. Важное значение имеет сбалансированное и
рациональное питание.
Экологические
факторы:загрязнение окружающей среды радиоактивными веществами, широкое
применение пестицидов в сельском хозяйстве, выбросами химических предприятий и
автотранспорта.
Медицинские
факторы: диагностические и лечебные медицинские манипуляции лекарственные
средства стресс.например рентгенография, травмы,операции,антибиотики. Стресс
приводит к нарушениям в работе Т-системы иммунитета действуя в первую очередь
через ЦНС.
Оценка
иммунного статуса
Можно
определить путем постановки комплекса лабороторных тестов включающих оценку
состояния факторов неспецифической резистентности гуморального(В-система) и
клеточного(Т-система)иммунитета.Оценка иммунного статуса проводится в клинике
при трансплантации органов и тканей аутоиммунных заболеваний аллергиях для
выявления иммунологической недостаточности при различных заболеваниях для
контроля эффективности лечения болезней связанных с нарушениями иммунной
системы.В зависимости от возможностей лаборотории оценка иммунного статуса чаще
всего базируется на определении комплекса следующих показателей:1.общего
клинического обследования2.состояния факторов естественной
резистентности3.гуморального иммунитета4.клеточного иммунитета5.дополнительных
тестов.При общем клиническом обследовании учитывают жалобы пациента
анамнез клинические симптомы результаты общего анализа крови,данные
биохимического исследования(спрашивают у пациента наличие профессиональных
вредностей,аллергии,инфекции, перенесенные в детстве заболевания,о
травмах,операциях,о лекарственных препаратах которые принимает,при осмотре
обращают внимание на чистоту кожных покровов и слизистых,при пальпации и
перкуссии уделяют внимание тимусу лимфатич узлам селезенке,обследуют анализ
крови о состоянии иммунокомпетентных клеток(лимфоциты,фагоциты). При
оценке состояния факторов резистентности определяют фагоцитоз компемент
интерфероновый статус колонизационную резистентность. Функциональную активность
фагоцитов определяют по их подвижности, адгезии,поглощению,расщеплению
захваченный частиц, образованию активных форм кислорода. С этой целью
используют такие тесты как определение фагоцитарного индекса,НСТ-тест и
др.Состояние системы комплемента определяют в реакции гемолиза. Интерфероновый
статус выявляют путем трирования на культуре клеток уровня интерферона в
сыворотке крови. Колонизационную резистентность определяют по степени дисбиоза
различных биотопов организма(чаще толстой кишки)
Гуморальный иммунитетопределяют по уровню иммуноглобулинов классов G,M,A.D,E в сыворотке крови количеству специфических антител,
катаболизму иммуноглобулинов, ГНТ, показателю В-лимфоцитов в переферической
крови и т.д. Для определения концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови
обычно используют иммунодиффузию по Манчини.Титр специфических антител
определяют в различных иммунологических реакциях(агглютинация, РПГА, ИФА и др.)
Число В-лимфоцитов устанавливают путем определения специфических рецепторов на
клетках с помощ моноклональных антител. фУнкциональное состояние В-лимфоцитов
определяют в реакции бласттрансформации путем стимуляции клеток митогенами,
например туберкулин и др. При оптимальных условиях культивирования В-лимф с
митогенами показатель трансформации в бласты может достигать 80%.Подсчет
бластов производят под микроскопом . Состояние клеточного иммунитетаоценивают по количеству Т-лимфоцитов а
также субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови, бласттрансформации
Т-лимф под действием Т-клеточных митогенов, определению гормонов тимуса, уровню
цитокинов, а также кожные пробы с аллергенами. Для постановки кожных
аллергических проб с используются антигены, к которым в норме должна быть
сенсибилизация, например проба Манту с туберкулином. Для определения числа
Т-лимфоцитов в периферической крови используют реакцию розеткообразования Е-РОК
поскольку эритроциты барана образуют с Т-лимфоцитами спонтанные розетки.
Бласттрансформацию Т-лимфоцитов определяют путем стимуляции Т-клеточными
митогенами. Для оценки состояния функции тимуса чаще всего применяют
определение уровня α1-тимозина и тимулина. В качестве дополнительных тестов для
оценки иммунного статуса можно использовать такие тесты как определение
бактерицидности сыворотки крови, титрование С3, С4 компонентов комплемента,
определение содержания С-реактивного белка в сыворотке крови. Все тесты
разделены на две группы: Тесты 1-го уровня могут быть выполнены в любой
клинической иммунологической лаборотории первичного звена здравоохранения, они
используются для первичного выявления лиц с явно выраженной иммунопатологией.
Они вкяючают в себя определение:
‘
общего и относительного числа лимфоцитов;
—основных субпопуляций (Т- и В-клетки);
—фагоцитарной активности лейкоцитов;
—концентрации иммуноглобулинов разных классов в
сыворотке крови.
Общее
(абсолютное) и относительное число лимфоцитов определяют по данным клинического
анализа крови. Содержание Т- и B-лимфоцитов подсчитывают в реакции
иммунофлюорес-ценции, используя меченые моноклональные флюоресцирующие
сыворотки к специфическим поверхностиым антигенным маркерам,
обозначаемым
символами CD(clasterdifferentiation). Таких
антигенных маркеров известно несколько десятков, но отдельные из них
характерны для того или иного типа клеток:
•
рецептор CD3 — всех ‘Г-лимфоцитов;
•
рецепторы CD 19, 20. 21, 72 — В-лимфоцитов;
•
рецепторы CD4 — Т-хелперы;
•
рецепторы CD8 — Т-супрессоры;
•
рецепторы CD 16 — NK-клетки
(натуральные киллеры).
Для более точной диагностики используются
тесты 2-го уровня позволяют провести более глубокий анализ состояния иммунной
системы и уточнить характер дефектов, выявленных с помощью тестов 1-го уровня.
К ним относятся, например, определение отдельных субклассов иммуноглобулинов
(особенно IgG, секреторного IgA) и B-лимфоцитов, регу-ляторных и эффекторных клеток.
Кроме того,
с помощью иммуноферментных и радиоиммунных методов можно определить
концентрации отдельных цитоки-нов главных регуляторных молекул,
определяющих тип иммунного ответа.