Оценка фагоцитарного звена иммунитета

Лабораторная оценка нарушений врожденного иммунитета

Функциональная оценка В-лимфоцитов

Определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях является одним из наиболее важных интегральных показателей функциональной полноценности В-лимфоцитов и всей системы регуляции гуморального адаптивного иммунитета.

Традиционно концентрацию сывороточных иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини.В настоящее время этот метод все еще находит свое применение, предпочтение отдается моноклональным антителам против отдельных антигенных детерминант (эпитопов), характерных для отдельных классов иммуноглобулинов.

Принцип метода Манчинизаключается в том, что образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агара, в которых содержатся антитела против IgM, IgG, IgA в стандартной концентрации. Иммуноглобулины, содержащиеся в исследуемой сыворотке, диффундируют в агар и при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитации. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Окончательный размер кольца преципитации зависит от концентрации соответствующих иммуноглобулинов. Метод Манчини позволяет определить концентрацию иммуноглобулинов, равную 10 мкг/мл. Ошибка метода составляет 10%.

Для диагностики нарушений врожденного иммунитета обычно определяют фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и оценивают состояние системы комплемента.

Наиболее информативными для оценки фагоцитарной системы следует считать фагоцитарный индекс, фагоцитарное число (отражает поглотительную способность нейтрофилов) и индекс бактерицидности (отражает переваривающую способность нейтрофила).

Фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.

Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число бактерий или частиц латекса, поглощенных в расчете на один нейтрофил.

Также проводятсятесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение).

При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 370 С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов, поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия –НСТ-тест позволяет оценить метаболическую активность гранулоцитов крови, выявляет резервные возможности внутриклеточных систем фагоцитов. НСТ-тест основан на восстановлении поглощенного лейкоцитами крови растворимого красителя – нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан черного цвета (внутриядерные включения – глыбки диформазана) под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции, инициирующей процесс стимуляции фагоцитоза.

Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия).

В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий E. coli или раствор пирогенала (липополисахарид S. typhi ) в разведении 1:10. На другое обезжиренное стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 минут. Готовят мазки, высушивают, фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая процент лейкоцитов с гранулами восстановленного НСТ (диформазан черного цвета).

Оценка активности фагоцитоза

ФЧ – фагоцитарное число (фагоцитарная активность) – это % профагоцитировавших клеток на 100 нейтрофилов

ФИ – фагоцитарный индекс – это среднее число бактерий в одном фагоците

Опсоно-фагоцитарный индекс – это соотношение фагоцитарного индекса иммунной сыворотки к фагоцитарному индексу нормальной сыворотки

Оценка миграционной активности фагоцитов

· Реакция направленного хемотаксиса

· РТМЛ (реакция торможения миграции лейкоцитов)

Оценка завершенности фагоцитоза

· Подращивание бактериально-лейкоцитарной смеси

· НСТ-тест (наличие активных форм кислорода) – взвесь нейтрофилов смешивают с нитросиним тетразолием и подсчитывают затем, после кратковременной инкубации, нейтрофилы с синими гранулами – доля нейтрофилов с синими гранулами служит показателем завершенности фагоцитоза

Комплекс тестов, с помощью которых диагностируются наиболее частые нарушения в иммунной системе:

оценка фагоцитоза:

· определение абсолютного числа нейтрофилов и моноцитов;

· определение интенсивности поглощения микробов фагоцитами;

· определение способности фагоцитов убивать микробы;

· определение интенсивности хемотаксиса фагоцитов и экспрессии молекул адгезии (CDlla, CDllb, CDllc, CD18) на по­верхностной мембране нейтрофилов;

оценка В-системы иммунитета:

· определение иммуноглобулинов G, А, М и Е в сыворотке крови;

· процентного и абсолютного количества В-лимфоцитов (CD 19, CD20) в периферической крови.

Их определение — главный метод диагностики всех форм иммунодефицитов, связанных с биосинтезом антител, которые проявляются прежде всего в виде длительно протекающих, рецидивирующих инфекций рес­пираторного тракта, хронических синуситов, отитов и др. В зависимости от формы иммунодефицита у таких больных могут наблюдаться диарея, лямблиоз, кожные поражения, злокачественные новообразования. Дефицит IgA часто ассоциируется с аутоиммунными и аллергическими заболеваниями. В последнем случае нередко повышен уровень IgE.

При оценке В-системы иммунитета рекомендовано определение как числа В-лимфоцитов, так и уровня иммуноглобулинов, что позволяет исследовать В-систему иммунитета как с количественной, так и с функциональной стороны.

Определение количества иммуноглобулинов позволяет судить не только о нормальном функционировании В-, но и косвенно о Т-системе иммунитета. Повышенный уровень IgE может свидетельствовать об усилении синтеза интерлейкина-4 и, следовательно, об усилении функции Т-хелперов.

Оценка количества иммуноглобулинов включает определение:

—субклассов иммуноглобулинов, особенно IgG;

—секреторного IgA;

—соотношения каппа- и лямбда-цепей;

—специфических антител к белковым и полисаха-ридным антигенам;

—способности лимфоцитов давать пролиферативный ответ на В-(стафилококк, липополисахарид) и Т-, В-(митоген лаконоса) митогены.

Определение содержания субклассов IgG представляет диагностическую ценность, так как при нормальном уровне IgG могут быть дефициты по субклассам иммуноглобулинов.

Важное функциональное свойство иммуноглобулинов — опсонизирующая активность. Выполнение нейтрофилом этой функции зависит от опсонизирующей активности сыворотки крови, где иммуноглобулинам и комплементу принадлежит ведущая роль.

Оценка Т-системы иммунитета:

Тесты 1-го уровня для оценки T-системы

· определение общего числа лимфоцитов;

· определение процентного и абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов (CD3) и двух основных их субпопуляций: хелперов/индукторов (CD4) и киллеров/супрессоров (CD8);

· определение пролиферативного ответа на основные Т-митогены: фитогемагглютинин и конканавалин А.