Полиморфизм генов врожденного иммунитета
Текст научной статьи
на тему «ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У БЕРЕМЕННЫХ С ЗАДЕРЖКОЙ РАЗВИТИЯ ПЛОДА»
РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 2, с. 192-194
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У БЕРЕМЕННЫХ С ЗАДЕРЖКОЙ РАЗВИТИЯ ПЛОДА
© 2010 г. М.М. Мироненко, Т.И. Долгих, Т.В. Кадцына
Центральная научно-исследовательская лаборатория, Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Росздрава»,
Омск, Россия
Поступила: 27.03.2010. Принята: 13.04.2010
На основании молекулярно-генетических исследований раскрыты возможные механизмы влияния полиморфизмов генов врожденного иммунного ответа на течение беременности у пациенток с задержкой развития плода. Предварительные результаты дают основание предполагать, что аллельные полиморфизмы генов врожденного иммунного ответа (159 С/Т в гене СШ4, Лгд753 С1п в гене ТЬЯ2 и 8ег249Рго в гене ТЬЯб) могут играть существенную роль в задержке развития плода инфекционного (вирусного) генеза.
Ключевые слова: задержка развития плода, полиморфизмы генов, врожденный иммунный ответ
ВВЕДЕНИЕ
Внутриутробная инфекция является причиной ряда заболеваний, в том числе задержки внутриутробного развития плода с последующим самопроизвольным выкидышем, рождением мертвого ребенка [1—5]. Одни и те же инфекционные агенты в одних случаях вызывают тяжелое поражение плода или невынашивание беременности, а в других — практически не влияют на ее течение. Согласно современным представлениям, причина этого — ограниченные возможности иммунной системы беременной к своевременному распознаванию и уничтожению этиологического агента инфекции. Иммунологическая защита против различных патогенов осуществляется в результате скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета [б, 7]. Врожденный компонент иммунной системы особенно важен для развития плода, когда система адаптивного иммунитета еще не сформирована. Полиморфизмы генов, зоной функциональной компетенции которых является врожденный иммунитет, могут быть причиной изменения иммунного ответа на инфекционный агент и, следовательно,
Адрес: 644001, г. Омск, ул. 20 лет РККА, 15. E-mail: dr_mmm@rambler.ru
развития осложнений беременности [б —8]. На молекулярно-клеточном уровне множественные взаимодействия микроорганизмов в системе паразит-хозяин вызывают разнообразные и многоуровневые ответы со стороны врожденного и адаптивного иммунитета. Первой линией защиты организма против микроорганизма является система врожденного иммунитета, которая обеспечивает быструю защиту от агента и определяет пути адаптивного иммунитета. Узнавание лиганда микроорганизма осуществляется рецепторами, распознающими патоген, в первую очередь рецепторами эндоцитоза (СБ14) и сигнальными рецепторами (То11-рецепторы). В основе причин тяжелого течения и летального исхода от внутриутробной инфекции может лежать аллельный полиморфизм генов, кодирующих синтез рецепторов, распознающих патоген. С ТЬИ-рецепторов происходит передача сигнала на молекулы, отвечающие за индукцию адаптивного иммунного ответа. [б, 7]. В зарубежной литературе описана корреляция тяжести течения внутриутробных инфекций с частотой точечных однонуклеотидных замен 159 С/Т в гене СБ14, Лгд753 С1п в гене ТЬИ2 и Бег249Рго в гене ТЬИб [9—11]. Вышеизложенное определило цель и задачи нашего исследования. Цель: установить роль полиморфизмов генов врожденного иммунного ответа в
Полиморфизмы генов врожденного иммунитета
193
задержке развития плода. Задачи: 1) установить этиологию возможной внутриутробной инфекции у беременных с задержкой развития плода; 2) изучить полиморфизмы генов системы иммунного ответа у беременных с задержкой развития плода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование носило характер аналитического, одномоментного, ретроспективного. Объектом настоящего исследования явились 30 беременных с подтвержденным диагнозом: «Задержка развития плода» — основная группа, которая состояла из 3 подгрупп в зависимости от степени тяжести: 1) 15 беременных с задержкой развития плода 1степени; 2) 10 беременных с задержкой развития плода 2 степени; 3) 5 беременных с задержкой развития плода 3 степени. Критериями оценки степени тяжести задержки развития плода являлись степень нарушения маточно-плацен-тарного и плодово-плацентарного кровотока. Контрольную группу составили беременные с физиологическим течением гестационно-го процесса — 27 женщин. Критерии оценки степени тяжести ЗРП основывались на степени нарушения маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока. У беременных оценивались акушерско-гинеколо-гический и соматический анамнез, паритет. По среднему возрасту (вариация от 24,0 лет до 30,7 лет) и срокам беременности (средние от 38 до 41 недель) пациентки сопоставимы. Всем женщинам была проведена этиологическая расшифровка возможной внутриутробной инфекции с использованием прямых (полимеразная цепная реакция, реакция им-мунофлюоресценции) и непрямых (иммуно-ферментный анализ) методов. При определении полиморфизмов генов образцы геномной ДНК выделяли из взвеси тканей с использованием комплекта реагентов «БЫР-экспресс» (производство компании «Литех», Москва). Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих указанные полиморфизмы и ДНК микроорганизмов, проводили на термоцик-лере «Терцик» на наборах компании «Литех» (г. Москва). Продукты амплификации, содержащие полиморфизмы, анализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл. Для статистической обработки
результатов исследования применялись методы описательной статистики. При оценке качественных признаков вычислялась их абсолютная и относительная частоты. Для расчетов использован статистический пакет Microsoft Excell 2007, программы «Biostat 4.03», «STATISTICA 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате анализа акушерско-гинеколо-гического анамнеза установлено, что в основной группе первобеременных было 14 (46,7%), а повторнобеременных 16 (53,3%) человек. Отягощенный акушерский анамнез имел место у 17 (57,7%) человек. Гинекологический анамнез осложнен у 16 (53,3%) человек: эрозией шейки матки у 16 (53.3%), хроническими воспалительными заболеваниями придатков у 5 (16,7%). У 26 человек (86,7%) выявлено наличие следующих инфекций в активной стадии: токсоплазмоз — 16,7%, герпетическая инфекция — 50%, цитомегаловирусная инфекция — 20%. Течение беременности осложнилось рецидивирующей угрозой прерывания беременности — у 5 (16,7%), гесто-зом — у 18 (60%). Задержка развития плода регистрировалась со 2 триместра беременности у 8 (26,7%), с 3 триместра — у 22 (73,3%) беременных. При исследовании полиморфизмов генов иммунного ответа в 50% случаев выявлено носительство мутантных аллелей генов врожденного иммунного ответа (5 случаев —159 C/T в гене CD14, 6 случаев — Arg753Gln, 1 случай Gln753Gln в гене TLR2, 3 случая — Ser249Pro в гене TLR6), ассоциированных с наличием генетического материала вирусов. Взаимосвязь полиморфизма генов иммунного ответа и наличием инфекционного агента подтверждалась наличием положительных ассоциативных связей (p < 0,05). Вероятно, наличие полиморфизмов в кодирующих областях генов CD 14, TLR-2, TLR-6 привело к нарушению трансдукции сигнала по MyD88-независимому пути и снижению активации генов, кодирующих синтез цито-кинов, вырабатываемых Т-хелперами 1 типа и клетками моноцитарно-макрофагального звена, и «неполноценной» противовирусной защите. Полагаем, что недостаточность врожденного иммунного ответа полностью элиминировать инфекционный агент способствовала инфекционной контаминации эндометрия, персистенции микроорганизмов и задержке развития плода. Таким образом, аллельные
194
Мироненко и др.
полиморфизмы генов врожденного иммунного ответа — может играть существенную роль в задержке развития плода инфекционного (вирусного) генеза.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают признательность Омской государственной медицинской академии в лице ректора профессора, д.м.н. Александра Ивановича Новикова за субсидирование в проведении исследований.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Врожденные, перинатальные и неонатальные инфекции. Под ред. А. Гриноу, Дж. Осборна, Ш. Сазерленд: Пер. с англ. М.: Медицина, 2000, 288.
2. Корнева М.Ю., Коровина Н.А., Заплатников А.Л. и др. Рос. вестн. перинатол. и педиатрии 2005, 2, 48-52.
3. Степаненко С.Ф. Сибирский медицинский журнал 2007, 3, 102-115.
4. Чебуркин А.В., Чебуркин А.А. Перинатальная инфекция: Пособие для врачей. М., 1999, 49.
5. Основы медицинской иммунологии. Под ред. Рабсон А., Ройт А., Делвз П.: Пер. с англ. М.: Бином, 2006, 319.
6. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. К.: ООО «Полиграф Плюс», 2006, 481.
7. Макаров О.В. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет. М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2007, 175.
8. Заплатников А.Л., Корнева М.Ю., Коровина Н.А. Рус. мед. журн. 2005, 13, 45-47.
9. Kang Y.A., Lee H.W., Kim Y.W., Han S.K., Shim Y.S., Yim J.J. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009, 6 (suppl.), 371-374.
10. Schröder N.W, Hermann C., Hamann L. J. Mol. Med. 2003, 6 (suppl.), 368-372.
11. Verstraelen H., Verhelst R., NuytinckL., Roelens K. Reprod. Immunol. 2009, 2 (suppl.), 163-173.
POLYMORPHISMS GENES OF CONGENITAL IMMUNITY AT PREGNANT WOMEN WITH THE FETAL ARREST
OF DEVELOPMENT
M.M. Mironenko, T.I. Dolgikh, T.V. Kadcina
Central Research Laboratory Omsk State Medical Academy Omsk, Russia
On the basis of molecular-genetic researches possible mechanisms of influence polymorphisms genes of the congenital immune answer to a current of pregnancy at patients with a fetal arrest of development are opened. Preliminary results give the grounds to assume that allele polymorphisms genes of the congenital immune answer (159 C/T in gene CD14, Arg753 Gln in gene TLR2 and Ser249Pro in gene TLR6) can play an essential role in an arrest of development of a fetal infectious (virus) genesis.
РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.
1. Основы иммуногенетики в клинической иммунологии Система лейкоцитарных антигенов человека (HLA система)
2.
HLA – Human Leukocyte Antigens
MHC – Major Histocompatibilyty
Complex
3. Иммуногенетика – одно из важных направлений иммунологии, изучающее генетический контроль иммунного ответа.
Главный комплекс гистосовместимости –
МНС (Major Histocompatibility Complex)
Ж.Снелл и П. Горер – открытие у мышей локуса
тканевой совместимости (Н-2)
Ж. Доссе (1952 г.) обнаружил в крови реципиента
после гемотрансфузии изоантитела против
лейкоцитов человека (HLA-B2)
Продукты генов МНС человека были названы HLA
(Human Leukocyte Antigens)
4. История изучения антигенов гистосовместимости :
1952 г. — открыт первый антиген гистосовместимости
человека (Ж.Доссэ);
1966 г. — доказана ведущая роль HLA антигенов в
развитии реакции отторжения трансплантата (Дж. ван
Рууд и др.);
1972 г. — установлена корреляция между аллельными
вариантами HLA антигенов и определенными
заболеваниями (З.Фалчук и др.);
1973 г. — установлена структура HLA антигенов класса I
(К.Накамура и др.);
1974 г. — показана роль антигенов гистосовместимости в
ограничении иммунного ответа (двойное
распознавание, Р.Цинкернагель, П.Доэрти);
5. История изучения антигенов гистосовместимости :
1980 г. – Нобелевская премия по медицине вручена Жану
Доссе, Баруху Бенасеррафу и Джорджу Снеллу за
открытие системы гистосовместимости.
1981 г. — осуществлено выделение и определение
аминокислотной последовательности антигенов HLA
класса II (Г.Кратцин и др.);
1983 г. — продемонстрирован биохимический
полиморфизм HLA антигенов (Р.Василов и др.);
1987 г. — определена пространственная структура HLA-A2
антигена (П.Бeркман и др.);
1991-1993 г. — установлен характер распределения HLA
антигенов в большинстве этнических групп планеты.
6.
Система HLA обеспечивает регуляцию
иммунного ответа путем ряда функций:
— презентации антигена Т-лимфоцитам;
— селекции и обучении Т- и В-лимфоцитов в отношении
«своего» и «не своего»;
— взаимодействия клеток иммунной системы;
— распознавания «своего» и «не своего», в т.ч. измененных
собственных клеток;
— участия в реакциях «РХПТ» и «РТПХ»;
— запуске, реализации и контроле иммунного ответа;
— формировании иммунологической толерантности, в т.ч. в
период беременности к полуаллогенному плоду;
— обеспечении выживаемости человека как вида в условиях
экзогенной и эндогенной агрессии
7. Особенности HLA-системы
• Полигенность (включает 224 локуса);
• Гены HLA характеризуются высоким
полиморфизмом;
• Наибольшим полиморфизмом обладают гены HLA 1
класса (HLA-А более 450 аллелъных вариантов, HLAВ более 780 и HLA-С более 238) и 2 класса (HLA-DR
– 440 аллелъных вариантов, HLA-DP- 124);
• Благодаря полиморфизму HLA обеспечивается
выживаемость человека в инфекционном окружении,
т.к. микроорганизмы обладают высокой
изменчивостью;
• Гены HLA наследуются кодоминантно, т.е. у
потомков экспрессируются одновременно гены,
полученные от обоих родителей.
8. HLA — система включает:
Гены гистосовместимости (расположены
в коротком плече 6 хромосомы у
человека).
Аг гистосовместимости – это
поверхностные структуры цитомембран
клеток, индуцирующие реакцию
отторжения, кодируемые генами
гистосовместимости.
9. HLA включает 3 класса генов:
• Гены 1 класса – (локусы HLA-А , HLA-В,
HLA-С) отличаются высоким полиморфизмом
и кодируют синтез молекул HLA 1 класса
• Гены 2 класса – (HLA-DR, HLA-DQ, HLADP) контролируют синтез молекул HLA 2
класса
• Гены 3 класса – кодируют молекулы
врожденного иммунитета (компоненты
комплемента С2, C4, ФНО, лимфотоксин,
фактор В, белки теплового шока и др.)
10. Строение HLA – системы (локализуется на коротком плече 6 аутосомной хромосомы между генами, кодирующими гипоксалазу (GLO) и
мочевой
пепсиноген-5 (Pg5)
HLA – система
состоит из
следующих
локусов:
А, В, С (I класс)
DP, DQ, DR (II класс)
Гены, кодирующие
молекулы
врожденного
иммунитета (III
класс )
11. Генная организация главного комплекса гистосовместимости у мышей и человека.
12. Характеристика генов и антигенов HLA-системы
Гены 1 класса (локусы А, В, С) – контролируют экспрессию
трансплантационных (SD) Аг
• SD- Аг экспрессируются на всех клетках
• Обладают консерватизмом, мало меняются в процессе
филогенеза
• Отличаются постоянством набора генов для данного вида
Аг HLA 1 класса
• Присутствуют практически на всех клетках организма, за
исключением ранних эмбриональных
• В наибольшем количестве представлены на лимфоцитах,
клетках эпителия и эндотелия.
• Аг локусов 1 класса занимают около 1% клеточной поверхности
• Выступают в качестве рецепторов для чужеродных Аг
• Обеспечивают взаимодействие между ИКК и другими клетками
организма
• Принадлежит ведущая роль во взаимодействии между клеткойэффектором и клеткой-мишенью в процессе иммунного ответа.
13. Характеристика генов и антигенов HLA- системы
Гены 2 класса
• принадлежат к D/ DR локусам
• Связаны с генами иммунного ответа Ir (Immune response)
Аг HLA 2 класса
• Опосредуют взаимодействие Т- , В-лимфоцитов и
макрофагов в иммунном ответе
• HLA-DR в наибольшем количестве представлены на Влимфоцитах, макрофагах, клетках эпителия и эндотелия
• Ir–Аг синтезируются и секретируются макрофагами,
экспрессируются на В-лимфоцитах (до 90%), Тлимфоцитах (до 50%)
• Главная функция Ir–Аг — обеспечение взаимодействия АПК
и ИКК в иммунном ответе
• Сцепленностью генов иммунного ответа (Ir-генов) с
определенными гаплотипами HLA объясняют развитие
различных иммунопатологий.
14. Строение HLA-Аг (MHC 1 и 2 класса)
• Состоят из
гликополипептидных
цепей α и β
• Каждая цепь включает
два наружных домена,
трансмембранную
часть и
цитоплазматический
участок
15.
Молекула МНС I
состоит из 2-х
полипептидных цепей –
α и β2 микроглобулина
Молекула МНС II
состоит из 2-х
трансмембранных
гликопротеинов α и β
цепей
16.
Гены НLA 3 класса – это область генома
внутри комплекса MHC 1 и 2 классов (локус BF),
в которой картированы гены, кодирующие синтез
следующих белков:
Компонентов комплемента (С2, C4a, C4b)
Цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1)
Гены 21-гидроксилазы – фермента,
участвующего в биосинтезе стероидных
гормонов
Аг НLA 3 класса – активация комплемента
классическим и альтернативным путем.
17. Механизмы связи HLA- системы с болезнями
Генетическая детерминированность –
истинное сцепление
«патологического» гена с антигенами
HLA, при котором «патологический»
ген передается по наследству
совместно с тем или иным локусом
HLA (например, дефицит С2, C4)
18. Механизмы связи HLA- системы с болезнями
Генетические ассоциации – объясняют 3 гипотезами:
Рецепторная – HLA-Аг рассматриваются как
рецепторы, взаимодействующие с некоторыми
вирусами, что облегчает их проникновение в
клетку.
Молекулярная мимикрия – структурное
сходство HLA-Аг с Аг некоторых вирусов и
бактерий, вследствие чего иммунная система
остается толерантной к чужеродным Аг.
Модификация HLA-Аг – изменение структуры
собственных Аг под действием вирусов или др.
чужеродных Аг, вследствие чего собственные Аг
распознаются как чужеродные (индукция
аутоиммунного процесса).
19. Ассоциация генов МНС с различными заболеваниями
20. Связь генов HLA с болезнями
Большинство аутоиммунных заболеваний
связано с генами HLA 2 класса
(инсулинзависимый сахарный диабет – с
аллелями DQ6 и DQ2, болезнь Бехтерева – с
аллелями B27, выявляемого у 95% больных)
Полиморфизм генов врожденного иммунитета,
например, TLR связан с развитием
аллергических, аутоиммунных и
инфекционных заболеваний
21. HLA типирование — исследование антигенов главного комплекса гистосовместимости человека
Задачи HLA типирования
• биологическая идентификация (HLA-тип
наследуется вместе с родительскими генами),
• определение предрасположенности к
различным заболеваниям,
• подбор доноров для пересадки органов
• диагностика иммунологических причин
бесплодия и привычного невынашивания
беременности.
22. Анализ полиморфизма HLA
• Серологический метод
(лимфоцитотоксический тест)
• Молекулярно-генетический метод (ПЦР
— полимеразная цепная реакция).
23. Лимфоцитотоксический тест
— К сывороткам против разных антигенов HLA
добавляют по 2000 исследуемых лимфоцитов.
— После инкубации добавляют комплемент (его
источником может служить кроличья сыворотка).
— Лимфоциты, несущие антиген, против которого
направлена сыворотка, под действием комплемента
разрушаются.
— Затем к лимфоцитам добавляют краситель, который
окрашивает только живые клетки.
Результат оценивают по относительному числу
погибших лимфоцитов. Резко положительный
результат свидетельствует о том, что лимфоциты
несут исследуемый антиген.
24.
25. Оценка результатов лимфоцитотоксического теста
Число погибших
Балл
клеток, %
Результат
0—10
1
Отрицательный
11—20
2
Сомнительный
21—50
4
Слабо
положительный
51—80
6
Положительный
81—100
8
Резко
положительный
26. Типирование HLA
Номер сыворотки
Специфичность
антител
Балл
1
Al
8
2
А1,А36
8
3
Al, A3, А11
6
4
А2
1
5
А2, А28
1
6
A3
8
7
АЗ,А1, 1В14
8
8
А23, А24
1
9
А24
1
Заключение: на исследуемых клетках присутствуют
антигены HLA-A3 и HI.A-A1
27. ПЦР
• Получение чистой геномной ДНК (из цельной
крови, лейкоцитарной суспензии, тканей).
• Затем образец ДНК копируется — амплифицируется
в пробирке с использованием праймеров (коротких
одноцепочечных ДНК), специфичных к
определенному HLA -локусу.
• После ПЦР, в ходе многократного копирования,
получается большое количество фрагментов ДНК,
которое можно оценить визуально. Для этого
реакционные смеси подвергают электролизу или
гибридизации, и определяют, произошла ли
специфическая амплификация, при помощи
программы или таблицы.