Принципы использования реакций иммунитета в диагностике
Реакции иммунитета применяются для диагностики инфекционных болезней, анализа антигенной структуры микроорганизмов, суждения об эволюционных и генетических связях различных видов организмов. В основу практического применения этих реакций положен принцип тесной физико-химической связи между антигенами и антителами, специфичности их взаимодействия. На основании этого принципа по одному известному компоненту можно делать заключение о природе другого, т. е. природу неизвестного возбудителя можно определить по известным антителам и наоборот. Реакции иммунитета дают возможность судить о динамике защитных свойств организма в процессе инфекционного заболевания, степени иммунитета, возникающего в случае применения предохранительных прививок.
Рассмотрим основные принципы реакций иммунитета, имеющие наиболее важное практическое значение, реакция агглютинации Реакция агглютинации протекает в две фазы. В первой фазе происходит адсорбция агглютининов на поверхности клетки, во второй образование агрегатов (агглютината) и выделение их в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролитов. Предполагалось, что антитела только изменяют чувствительность клеток, а сам феномен осуществляется в результате воздействия электролитов. В настоящее время считается, что процесс агглютинации происходит в соответствии с теорией решетки, согласно которой агглютинат образуется вследствие того, что двухвалентные антитела, одним активным центром соединяющиеся с одной клеткой, другим с другой, образуют плотное их соединение и выпадение в осадок. В пользу этой точки зрения говорят данные, что при образовании агглютината существенное значение имеют определенные количественные соотношения антигена и антител (феномен оптимума) и задержка агглютинации при избытке или недостатке антител. Эти реакции применяются для диагностики инфекционных заболеваний, определения природы возбудителей и их атттигешгай структуры.
13. Реакции по типу агглютинации: реакция агглютинации на стекле и развернутая, реакция непрямой гемагглютинации. Механизмы реакций, компоненты. Применение.
Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора
натрия хлорида.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:
1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;
2) определения возбудителя, выделенного от больного;
3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.
Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция
агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) —крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя.
Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.
Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии
Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 1399 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов
Читайте также:
Рекомендуемый контект:
Поиск на сайте:
© 2015-2020 lektsii.org — Контакты — Последнее добавление
Реакции иммунитета — это реакции между антигеном и антителом. Основная их характеристика – специфичность.
Любую реакцию иммунитета можно описать в виде простейшего равенства АНТИГЕН + АНТИТЕЛО = РЕЗУЛЬТАТ.
При этом необходимо отметить, что каким бы ни был результат — положительным или отрицательным, он может быть зарегистрирован визуально или с помощью тех или иных приборных методов, т.е. известен. Исходя из этого, по известному результату и одному из компонентов реакции иммунитета всегда можно определить второй, неизвестный компонент.
Реакции иммунитета, в которых по известному результату и известному антителу определяют природу неизвестного антигена, составляют суть метода иммуноиндикации.
Реакции иммунитета, в которых по известному результату и известному антигену определяют природу неизвестных антител, составляют суть метода серологической диагностики.
Реакции иммунитета характеризуются специфичностью, т.е. способностью антигена (антитела) вступать в реакцию только с соответствующим антителом (антигеном), и чувствительностью, т.е. минимальным количеством антигенов или антител, которое выявляет данная реакция. Некоторые современные методики обладают очень высокой
чувствительностью и позволяют обнаруживать единичные молекулы антигена или антитела.
Исходя из принципа специфичности, результат реакции будет положительным, если антиген и антитело, участвующие в ней, соответствуют друг другу.
Если же антиген и антитело не соответствуют друг другу, то результат будет отрицательным.
Все известные в настоящее время реакции иммунитета, лежащие в основе иммунодиагностики, делят на простые (прямые, двухкомпонентные, осадочные) и сложные (непрямые, многокомпонентные). К первым относят реакции агглютинации и ее модификации (пассивной гемагглютинации, латекс-агглютинации) и преципитации, ко
вторым — РСК, ИФА, РИФ, РИА, реакции потребления (нейтрализации) антигенов, антител и др.
Для иммунодиагностики (серодиагностики и иммуноиндикации) используются следующие реакции иммунитета.
1)Реакция агглютинации — это склеивание и осаждение корпускулярного антигена (целых бактериальных клеток, эритроцитов, лейкоцитов и т.д.) под действием антител в присутствии электролита.
Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации:
а) объемная агглютинация в пробирках (классическая);
б) агглютинации на предметном стекле.
Кроме того, известны модификации самой реакции агглютинации, которые имеют более высокую чувствительность и легче регистрируются. Среди них наиболее широко используются реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА/РПГА), латекс-агглютинации, ко-агглютинации, антиглобулиновый тест (реакция Кумбса).
В РПГА один из компонентов (антиген, или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании комплекса антиген-антитело склеиваются и выпадают в осадок. В латекс-агглютинации в качестве сорбента используют частицы латекса, а в ко-агглютинации — клетки золотистых стафилококков.
Реакцию агглютинации можно использовать для серодиагностики и иммуноидентификации, а ее модификации (латекс-агглютинация, ко-агглютинация) – для иммуноиндикации.
Реакция агглютинации – единственная из реакций иммунитета, которая применяется для серологической идентификации бактерий. С помощью этой простой, прямой реакции иммунитета изучают антигенные свойства бактерий, что необходимо для установления их таксономического положения. Она применяется как заключительный этап бактериологического исследования и носит название — реакция агглютинации по идентификации. В качестве антигена выступает чистая культура бактерий, а известные антитела содержатся в агглютинирующей сыворотке. Она используется для определения видовой принадлежности бактерий или для определения серогрупп и сероваров.
Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса) разработан и используется только для выявления неполных антител. При этой реакции при взаимодействии корпускулярного антигена с неполными антителами видимая агглютинация или гемагглютинация произойдет только после добавления антиглобулиновой сыворотки (сыворотка животного, чаще кролика, содержащая антитела к иммуноглобулинам человека).
2)Реакция преципитации — это осаждение антигена (полисахариды, токсины, ферменты, глобулины) из раствора под действием антител в присутствии электролита.
Существует несколько способов реализации этой реакции — кольцепреципитация, преципитация в геле (агаре) (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони), реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини), иммуноэлектрофорез.
По своей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглютинации. Основным различием между ними является то, что в реакции агглютинации участвует корпускулярный антиген, а в реакции преципитации — растворимый.
Реакция преципитации чаще всего используется для иммуноиндикации (реакция Асколи) или для определения токсигенности дифтерийных бактерий (модификация реакции Оухтерлони в виде реакции двойной иммунодиффузии в агаре), или при определении содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов (реакция Манчини в виде реакции радиальной иммунодиффузии).
Разновидностью реакции преципитации является реакция флоккуляции – появление опалесценции или хлопьевидной массы при реакции токсин – антитоксин, или анатоксин – антитоксин и применяется для определения активности (титрования) различных токсинов, анатоксинов или антитоксических сывороток.
3)Реакция иммунного лизиса — растворение комплекса клеточного антигена и антител под действием комплемента.
Это реакции бактериолизиса, иммунного гемолиза. Последняя используется как индикаторная в реакции связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) — сложная, многокомпонентная непрямая реакция иммунитета.
В ее состав входят две системы: исследуемая, состоящая из антигена и антитела (один из них неизвестен), в которую вносится также и комплемент, и индикаторная (гемолитическая), состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним, т.е. заведомо подходящую друг другу пару антиген-антитело, которая в случае воздействия комплемента приводит к образованию так называемой «лаковой крови» (гемолизированных эритроцитов).
Если в 1-й исследуемой системе антиген и антитело соответствуют друг другу, то они образуют комплекс, и этот комплекс связывает комплемент. В
этом случае в индикаторной системе изменений не произойдет, и негемолизированные эритроциты просто осядут на дно пробирки.
Если же в 1-й исследуемой системе антиген и антитело не соответствуют друг другу, то комплекс антиген-антитело не образуется, и комплемент остается свободным. В этом случае он связывается комплексом антиген-антитело 2-й, индикаторной системы, и тем самым обуславливает гемолиз эритроцитов.
РСК не имеет ограничений по природе антигенов и широко используется как для серодиагностики бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, так и для индикации их антигенов.
4)Реакция токсиннейтрализации (in vivo), используемая в основном для определения типа токсина различных возбудителей, например, ботулизма, и титрования антитоксических сывороток. Смесь токсина и антитоксической сыворотки вводят белым мышам, и если они соответствуют друг другу, т.е. нейтрализуются, то мыши не погибают.
5)Реакции с участием меченых антигенов или антител.
а)Радиоиммунный анализ (РИА) — основан на использовании меченных, например, радиоактивным йодом 125I, 131I или радиоактивным водородом H2, антител. Образующийся комплекс антиген-антитело содержит радиоактивную метку и легко обнаруживается с помощью соответствующих приборов (радиометров). При этом можно измерить не только наличие радиоактивности, но и ее интенсивность.
б)Реакция иммунофлюоресценции — основана на том, что антитела иммунной сыворотки метят флюорохромами.
Образовавшийся комплекс антиген-антитело легко обнаружить по наличию этой светящейся метки при люминесцентной микроскопии. Это так называемая реакция прямой иммунофлюоресценции.
Реакция иммунофлюоресценции может быть поставлена и в непрямом варианте реакции, когда свечение комплексу антиген-антитело придает меченная флюорохромом антиглобулиновая сыворотка, вступающая во взаимодействие с антителами иммунной сыворотки.
в)твердофазный иммуно-ферментный анализ (ИФА). В этой реакции ее компонент метят не радиоактивной или флюоресцирующей меткой, а ферментом (пероксидаза хрена), который при положительном результате реакции включается в комплекс антиген-антитело. При добавлении к такому комплексу соответствующего субстрата происходит реакция фермент-субстрат, что легко регистрируется по изменению окраски.
г)иммуноблоттинг – определение антигенов или антител с помощью известных сывороток или антигенов, при котором искомый компонент выделяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносится на специальную подложку (блот-пятно), а затем выявляется на ней с помощью иммуноферментного анализа.
6)Реакции потребления.
Это сложные многокомпонентные реакции иммунитета. Они могут быть использованы в трех вариантах: реакция потребления антигена (РПАГ),реакция потребления антитела (РПАТ) и реакция потребления комплемента (РПК).
Разберем сущность этих реакций на примере РПАГ.
На первом этапе в реакцию вводят строго определенное количество антигена (известный компонент). К нему добавляют исследуемый материал, в котором ищут антитела. Если они имеются, то, взаимодействуя с антигеном, потребляют его. Если их нет, то антиген не потребляется и его количество не изменяется.
На втором этапе реакции количество антигена титруется соответствующей ему антисывороткой. Снижение (потребление) количества антигена по сравнению с введенным в реакцию свидетельствует о наличии в исследуемом материале антител к этому антигену. Исходя из количества потребленного антигена рассчитывается количество антител в единице объема (массы) исследуемого материала.
При постановке РПАТ решается обратная задача.
Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным реакциям, т.к. в ней участвует комплемент и две специфические системы антиген-антитело. Первая система стоит из антигена и антитела, вторая (индикаторная) – из эритроцитов барана и соответствующей им гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, реагируя с эритроцитами, делает их чувствительными (сенсибилизирует) к действию комплемента, в присутствии которого эритроциты разрушаются (лизируются).
РСК протекает в две фазы. В первой (специфической) взаимодействуют антиген, антитело и комплемент. Если антиген соответствует антителу, они соединяются и образуют комплекс, который связывает комплемент. Образовавшийся комплекс визуально не определяется и выявляется индикаторной гемолитической системой, участвующей во второй (индикаторной) фазе реакции. Если после добавления индикаторной системы гемолиза эритроцитов не наступает, комплемент связан первой системой и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу. Поэтому отсутствие гемолиза оценивается как положительный результат РСК (рис. 38, см. приложение). Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным, вызывая гемолиз эритроцитов. Таким образом, наличие гемолиза свидетельствует об отрицательном результате РСК.
РСК, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, нашла широкое применение в серодиагностике ряда инфекционных болезней и идентификации антигенов. Реакция применяется при диагностике сифилиса, других спирохетозов, риккетсиозов, вирусных и других инфекций.
Реакция нейтрализации используется при определении активности микробных (или другого происхождения) экзотоксинов. Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие токсина. Существуют 2 варианта постановки реакции: in vivo и in vitro.
Первый вариант заключается в том, что готовят последовательные разведения антитоксической сыворотки, затем к каждому разведению добавляют определенную дозу токсина, смесь выдерживают 2 часа при температуре 370 С, после чего вводят чувствительным животным. При нейтрализации токсина антитоксином животные не погибают.
Второй вариант реакции основан на феномене нейтрализации действия микробного токсина (например, гемолитического — 0-стрептолизина патогенного стрептококка) антитоксическими антителами иммунной сыворотки в пробирке. Отсутствие гемолиза свидетельствует о наличии антитоксических антител.
Другим вариантом реакции нейтрализации in vitro является флоккуляция, при которой при взаимодействии токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (инициальная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях. Флоккуляция является специфической реакцией и ее используют в сывороточном производстве для определения степени активности или установления силы действия антитоксических сывороток.
Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекционных болезней (сибирской язвы, менингококковой и пневмококковой инфекций). В судебно-медицинской практике ее используют для определения видовой принадлежности крови и т. д.; при проведении санитарно-гигиенических исследований для установления фальсификации продуктов. Эта реакция служит также для определения филогенетического родства животных, растений и микроорганизмов. В качестве антигена используют полноценные белковые антигены, а также гаптены (полисахаридные, липополисахаридные, гликопротеидные) микроорганизмов или высших организмов. Иммунную преципитирующую сыворотку, содержащую антитела, применяют неразведенной или в небольшом разведении (1:5-1:10). Основными методами реакции являются кольцепреципитация и реакция преципитации в геле.
Реакцию кольцепреципитации ставят в специальных преципитационных пробирках (диаметр 0,4-0,5 см, высота 7—8 см). В пробирку вносят 0,2 мл иммунной сыворотки, на которую осторожно наслаивают такой же объем антигена. Параллельно в том же объеме ставят контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками, контроль антигена (антиген в изотоническом растворе хлорида натрия), контроль сыворотки (исследуемая сыворотка в изотоническом растворе хлорида натрия). Реакцию учитывают после 5-30 минутной инкубации в термостате при 370С. Положительный результат характеризуется появлением белого кольца (преципитата) на границе антигена и антитела.
Реакция диффузной преципитации в геле (агаровом, крахмальном, полиакриламидном) по Оухтерлони позволяет четко разграничить преципитаты, образованные различными системами антиген-антитело, в разных участках геля, а также детально изучать состав сложных водорастворимых антигенных комплексов. В слое застывшего агара пробиваются лунки. В одну лунку помещают жидкость, содержащую исследуемый антиген, в другую – стандартную иммунную сыворотку. Компоненты, входящие в состав антигена, диффундируют навстречу соответствующему антителу с различной скоростью. Комплекс антиген – антитело расположен в различных участках геля, где образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Метод широко используется для определения токсигенности дифтерийных бактерий, определения иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови человека и т.д.
Реакция радиальной иммунодиффузия по Манчини также основана на реакции преципитации. При соотношении антигена и антитела, близком к оптимальному, образуется кольцо преципитации. Чем выше концентрация внесенного в лунку антигена, тем больше диаметр кольца. Чем выше концентрация антигена, тем на большее расстояние он продиффундирует до того, как сформируется кольцо, и тем шире будет диаметр этого кольца. Если в реакции использовать 3 стандарта с известной концентрацией антигена, то можно получить калибровочную кривую. Такой подход можно использовать для определения концентрации иммуноглобулинов, компонента комплемента С и т.д.
Иммуноэлектрофорез основан на принципе сочетания электрофореза и реакции преципитации в геле. С помощью этого метода анализируют различные антигены микробов и вирусов, антитела, сыворотку крови человека, ликвор и т.д. Исследуемый материал вносят в лунку, расположенную в геле на стеклянной пластине и разделяют его фракции электрофорезом. Затем в траншею, вырезанную в геле параллельно линии электрофоретической миграции белков, вносят сыворотки против антигенов, которые хотят обнаружить (например, против антигенов менингококка). Антитела сыворотки диффундируют в агар и в местах встречи с соответствующими антигенами образуют зоны преципитации в виде дуги.
Определение неполных антител (реакция Кумбса).Эта реакция позволяет выявить неполные (одновалентные) антитела, которые при соединении с эритроцитами, бактериями и риккетсиями не дают видимых эффектов реакции антиген-антитело, появляясь в крови больных в более ранние сроки и в более высоких титрах, чем полные. Прибавление кроличьей сыворотки против глобулинов человека приводит к агглютинации, т.к. антитела этой сыворотки бивалентны и взаимодействуют с неполными антителами, связанными с поверхностными антигенами бактерий или эритроцитов, с образованием видимого осадка в виде зонтика.