Реакции иммунитета для серодиагностики
В связи с высокой специфичностью и чувствительностью реакции взаимодействия антигена и соответствующего ему антитела эти реакции широко применяются для лабораторной диагностики инфекционных болезней.
Серологические реакции применяют в двух направлениях:
1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью известного антигена (серологический метод диагностики инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма при его идентификации с помощью известного антитела.
В зависимости от свойств антигена и особенностей среды, в которой взаимодействуют антигены и антитела, различают реакцию агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, нейтрализации и др.
Реакции агглютинации (РА) — склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток под действием антител в присутствии солей (обычно используется изотонический раствор хлорида натрия). Определяемые антитела (агглютинины) находятся либо в сыворотке крови больного человека либо иммунного животного; антигеном является взвесь убитых или живых микроорганизмов.
Для получения сыворотки кровь у человека берут обычно из вены, собирают в стерильную пробирку, оставляют на час при комнатной температуре или при 370 С на 30 мин. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой, пробирку оставляют в холодильнике на ночь для лучшего отделения сыворотки. На следующий день сыворотку отсасывают, при необходимости освобождают от форменных элементов крови центрифугированием.
Иммунные диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенному антигену, получают чаще из крови кроликов или лошадей, многократно иммунизированных соответствующим антигеном (взвесь живых или убитых микроорганизмов, анатоксины, экстракты клеток и тканей, эритроциты и т. п.). Нередко такие сыворотки, содержат групповые антитела, агглютинируя родственные между собой микробные виды, содержащие общий групповой антиген. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба. Устраняют групповую агглютинацию путем смешивания сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что приводит к адсорбции на их поверхности соответствующих антител (метод Кастеллани). В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба или его антигена. Полученная сыворотка является строго специфичной и называется адсорбированной (типовой, монорецепторной).
Для определения антител в крови больного человека можно использовать живые культуры микроорганизмов, однако чаще используются взвеси убитых микроорганизмов (диагностикумы). Реакция агглютинации ставится в 2 вариантах: ориентировочная реакции на стекле и развернутая реакция в пробирках.
Для постановки ориентировочной реакции агглютинации на предметное стекло наносят по 2 капли известной сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора вносят петлей культуру исследуемого микроорганизма, тщательно перемешивают и через 1-3 минуты учитывают реакцию. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контрольной. Реакция считается положительной в том случае, когда в капле, где культура смешана с сывороткой, выпадают хлопья агглютината, контроль сыворотки остается прозрачным, а в контроле антигена отмечается равномерное помутнение (рис.35, см. приложение).
Постановка развернутой реакции агглютинации предполагает приготовление разведений (обычно двукратных в объеме 1,0 мл) известной диагностической или исследуемой от больного человека сыворотки, в которые добавляют 0,1 мл (2 капли) живых или убитых микроорганизмов. В качестве двух контролей используют сыворотку в максимальной концентрации (антиген в нее не вносят), а также изотонический раствор хлорида натрия, в который вносят антиген. Положительная реакция характеризуется выпадением на дно пробирок хлопьевидного или зернистого осадка в виде зонтика, жидкость над осадком при этом просветляется. При встряхивании осадка (агглютината) видны хлопья, плавающие в прозрачной жидкости. В контроле антигена наблюдается осадок в виде пуговки (при встряхивании — равномерное помутнение), в контроле сыворотки – полная прозрачность (рис. 12).
| Рис. 12. Развернутая реакция агглютинации |
В практической работе нередко ставят РА по типу Видаля, основывающейся на обнаружении агглютининов (антител) в сыворотке крови больных. Эта реакция используется с целью подтверждения инфекционной болезни, вызванной тем или иным возбудителем: для диагностики брюшного тифа (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция с риккетсиями Провачека), бруцеллеза (реакция Райта и Хеддельсона), туляремии и других заболеваний. Реакцию проводят на второй неделе заболевания, когда в крови накапливается достаточно высокий титр антител к возбудителю.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)—агглютинация эритроцитов, нагруженных антигеном или антителом, под влиянием специфических антител или антигенов с целью определения неизвестных антител или антигенов (рис. 13, рис. 34, см. приложение). Реакцию ставят в специальных полистироловых планшетах (обычно в двукратных разведениях сыворотки или материала, содержащего антиген, объемом 0,2 мл), добавляют соответствующий антигенный или антительный эритроцитарный диагностикум, выдерживают в термостате при 370 С или при комнатной температуре 2 часа, учет производят сразу после этого или на следующий день. Контролем служит взвесь эритроцитов с заведомо иммунной и нормальной сыворотками. В первом случае должна произойти агглютинация, во втором ее не должно быть. Контролем антигена служит взвесь нормальных эритроцитов, к которым добавлена испытуемая сыворотка, а также раствор хлорида натрия, к которому добавляют эритроцитарный диагностикум (в обоих контролях не должно быть агглютинации).
| Рис. 13. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации — РНГА |
Реакция латекс-агглютинации – агглютинация частиц полистирольного латекса, нагруженных антигенами или антителами, в присутствии соответственно антител или антигенов.
Реакция угольной агломерации (РУА) выполняется аналогично реакции латекс-агглютинации, однако вместо частиц полистирольного латекса используют мелкодисперный уголь с адсорбированными на нем специфическими моноклональными антителами.
Реакция коагглютинации основана на способности белка А золотистого стафилококка вступать в реакцию с Fc-фрагментом иммуноглобулина G. Fab фрагменты IgG, обладающие функцией антител за счет активных центров, вступают в специфическую реакцию с гомологичным антигеном, вызывая агглютинацию стафилококка.
Опсонофагоцитарная проба. Опсонины представляют собой сывороточные белки (антитела, компоненты комплемента и др.), усиливающие фагоцитоз. Опсоно-фагоцитарную ставят при бруцеллезе, сыпном тифе и других болезнях. Учитывают реакцию по данным определения фагоцитарного показателя (среднее количество микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом при подсчете в мазке не менее 100 фагоцитов), опсонического индекса (ОИ — отношение фагоцитарного показателя иммунной сыворотки к фагоцитарному показателю нормальной сыворотки), опсоно-фагоцитарного индекса (ОФИ) и титра опсонинов (ТО).
Для определения ОИ исследуемый и контрольный образцы крови инкубируют 15 мин в смеси со стандартным количеством тест частиц (микроорганизмы, грибы, латекс). Из каждой пробы готовят мазки, фиксируют их жидким фиксатором, окрашивают метиленовой синькой или по Романовскому-Гимза. Подсчитывают число фагоцитарных частиц в 100 фагоцитах, находят фагоцитарные числа обеих проб и устанавливают ОИ.
ОФИ, в отличие от ОИ, отражает состояние и изменение опсонических свойств, вызванные антителами и комплементом, и фагоцитарной активности лейкоцитов больного к специфическому возбудителю. Методика постановки и учета ОФИ при разных заболеваниях различна (визуальная, культуральная, изотопная). При визуальном варианте в пробирку с 0,25 мл 2% раствора цитрата натрия добавляют 0,5 мл крови больного и 0,25 мл гретой суточной агаровой культуры возбудителя заболевания плотностью 1 млрд/мл (по кишечному стандарту). Смесь инкубируют 30 мин при 37°, а затем поступают так, как при определении ОИ.
Титр опсонинов (ТО) количественно характеризует силу опсонической активности по отношению к специфическому возбудителю. В отличие от ОФИ здесь исключается влияние изменений со стороны фагоцитов, т.к. в опыт берут лейкоциты или макрофаги здорового человека.
Реакции иммунитета — это реакции между антигеном и антителом. Основная их характеристика – специфичность.
Любую реакцию иммунитета можно описать в виде простейшего равенства АНТИГЕН + АНТИТЕЛО = РЕЗУЛЬТАТ.
При этом необходимо отметить, что каким бы ни был результат — положительным или отрицательным, он может быть зарегистрирован визуально или с помощью тех или иных приборных методов, т.е. известен. Исходя из этого, по известному результату и одному из компонентов реакции иммунитета всегда можно определить второй, неизвестный компонент.
Реакции иммунитета, в которых по известному результату и известному антителу определяют природу неизвестного антигена, составляют суть метода иммуноиндикации.
Реакции иммунитета, в которых по известному результату и известному антигену определяют природу неизвестных антител, составляют суть метода серологической диагностики.
Реакции иммунитета характеризуются специфичностью, т.е. способностью антигена (антитела) вступать в реакцию только с соответствующим антителом (антигеном), и чувствительностью, т.е. минимальным количеством антигенов или антител, которое выявляет данная реакция. Некоторые современные методики обладают очень высокой
чувствительностью и позволяют обнаруживать единичные молекулы антигена или антитела.
Исходя из принципа специфичности, результат реакции будет положительным, если антиген и антитело, участвующие в ней, соответствуют друг другу.
Если же антиген и антитело не соответствуют друг другу, то результат будет отрицательным.
Все известные в настоящее время реакции иммунитета, лежащие в основе иммунодиагностики, делят на простые (прямые, двухкомпонентные, осадочные) и сложные (непрямые, многокомпонентные). К первым относят реакции агглютинации и ее модификации (пассивной гемагглютинации, латекс-агглютинации) и преципитации, ко
вторым — РСК, ИФА, РИФ, РИА, реакции потребления (нейтрализации) антигенов, антител и др.
Для иммунодиагностики (серодиагностики и иммуноиндикации) используются следующие реакции иммунитета.
1)Реакция агглютинации — это склеивание и осаждение корпускулярного антигена (целых бактериальных клеток, эритроцитов, лейкоцитов и т.д.) под действием антител в присутствии электролита.
Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации:
а) объемная агглютинация в пробирках (классическая);
б) агглютинации на предметном стекле.
Кроме того, известны модификации самой реакции агглютинации, которые имеют более высокую чувствительность и легче регистрируются. Среди них наиболее широко используются реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА/РПГА), латекс-агглютинации, ко-агглютинации, антиглобулиновый тест (реакция Кумбса).
В РПГА один из компонентов (антиген, или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании комплекса антиген-антитело склеиваются и выпадают в осадок. В латекс-агглютинации в качестве сорбента используют частицы латекса, а в ко-агглютинации — клетки золотистых стафилококков.
Реакцию агглютинации можно использовать для серодиагностики и иммуноидентификации, а ее модификации (латекс-агглютинация, ко-агглютинация) – для иммуноиндикации.
Реакция агглютинации – единственная из реакций иммунитета, которая применяется для серологической идентификации бактерий. С помощью этой простой, прямой реакции иммунитета изучают антигенные свойства бактерий, что необходимо для установления их таксономического положения. Она применяется как заключительный этап бактериологического исследования и носит название — реакция агглютинации по идентификации. В качестве антигена выступает чистая культура бактерий, а известные антитела содержатся в агглютинирующей сыворотке. Она используется для определения видовой принадлежности бактерий или для определения серогрупп и сероваров.
Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса) разработан и используется только для выявления неполных антител. При этой реакции при взаимодействии корпускулярного антигена с неполными антителами видимая агглютинация или гемагглютинация произойдет только после добавления антиглобулиновой сыворотки (сыворотка животного, чаще кролика, содержащая антитела к иммуноглобулинам человека).
2)Реакция преципитации — это осаждение антигена (полисахариды, токсины, ферменты, глобулины) из раствора под действием антител в присутствии электролита.
Существует несколько способов реализации этой реакции — кольцепреципитация, преципитация в геле (агаре) (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони), реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини), иммуноэлектрофорез.
По своей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглютинации. Основным различием между ними является то, что в реакции агглютинации участвует корпускулярный антиген, а в реакции преципитации — растворимый.
Реакция преципитации чаще всего используется для иммуноиндикации (реакция Асколи) или для определения токсигенности дифтерийных бактерий (модификация реакции Оухтерлони в виде реакции двойной иммунодиффузии в агаре), или при определении содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов (реакция Манчини в виде реакции радиальной иммунодиффузии).
Разновидностью реакции преципитации является реакция флоккуляции – появление опалесценции или хлопьевидной массы при реакции токсин – антитоксин, или анатоксин – антитоксин и применяется для определения активности (титрования) различных токсинов, анатоксинов или антитоксических сывороток.
3)Реакция иммунного лизиса — растворение комплекса клеточного антигена и антител под действием комплемента.
Это реакции бактериолизиса, иммунного гемолиза. Последняя используется как индикаторная в реакции связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) — сложная, многокомпонентная непрямая реакция иммунитета.
В ее состав входят две системы: исследуемая, состоящая из антигена и антитела (один из них неизвестен), в которую вносится также и комплемент, и индикаторная (гемолитическая), состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним, т.е. заведомо подходящую друг другу пару антиген-антитело, которая в случае воздействия комплемента приводит к образованию так называемой «лаковой крови» (гемолизированных эритроцитов).
Если в 1-й исследуемой системе антиген и антитело соответствуют друг другу, то они образуют комплекс, и этот комплекс связывает комплемент. В
этом случае в индикаторной системе изменений не произойдет, и негемолизированные эритроциты просто осядут на дно пробирки.
Если же в 1-й исследуемой системе антиген и антитело не соответствуют друг другу, то комплекс антиген-антитело не образуется, и комплемент остается свободным. В этом случае он связывается комплексом антиген-антитело 2-й, индикаторной системы, и тем самым обуславливает гемолиз эритроцитов.
РСК не имеет ограничений по природе антигенов и широко используется как для серодиагностики бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, так и для индикации их антигенов.
4)Реакция токсиннейтрализации (in vivo), используемая в основном для определения типа токсина различных возбудителей, например, ботулизма, и титрования антитоксических сывороток. Смесь токсина и антитоксической сыворотки вводят белым мышам, и если они соответствуют друг другу, т.е. нейтрализуются, то мыши не погибают.
5)Реакции с участием меченых антигенов или антител.
а)Радиоиммунный анализ (РИА) — основан на использовании меченных, например, радиоактивным йодом 125I, 131I или радиоактивным водородом H2, антител. Образующийся комплекс антиген-антитело содержит радиоактивную метку и легко обнаруживается с помощью соответствующих приборов (радиометров). При этом можно измерить не только наличие радиоактивности, но и ее интенсивность.
б)Реакция иммунофлюоресценции — основана на том, что антитела иммунной сыворотки метят флюорохромами.
Образовавшийся комплекс антиген-антитело легко обнаружить по наличию этой светящейся метки при люминесцентной микроскопии. Это так называемая реакция прямой иммунофлюоресценции.
Реакция иммунофлюоресценции может быть поставлена и в непрямом варианте реакции, когда свечение комплексу антиген-антитело придает меченная флюорохромом антиглобулиновая сыворотка, вступающая во взаимодействие с антителами иммунной сыворотки.
в)твердофазный иммуно-ферментный анализ (ИФА). В этой реакции ее компонент метят не радиоактивной или флюоресцирующей меткой, а ферментом (пероксидаза хрена), который при положительном результате реакции включается в комплекс антиген-антитело. При добавлении к такому комплексу соответствующего субстрата происходит реакция фермент-субстрат, что легко регистрируется по изменению окраски.
г)иммуноблоттинг – определение антигенов или антител с помощью известных сывороток или антигенов, при котором искомый компонент выделяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносится на специальную подложку (блот-пятно), а затем выявляется на ней с помощью иммуноферментного анализа.
6)Реакции потребления.
Это сложные многокомпонентные реакции иммунитета. Они могут быть использованы в трех вариантах: реакция потребления антигена (РПАГ),реакция потребления антитела (РПАТ) и реакция потребления комплемента (РПК).
Разберем сущность этих реакций на примере РПАГ.
На первом этапе в реакцию вводят строго определенное количество антигена (известный компонент). К нему добавляют исследуемый материал, в котором ищут антитела. Если они имеются, то, взаимодействуя с антигеном, потребляют его. Если их нет, то антиген не потребляется и его количество не изменяется.
На втором этапе реакции количество антигена титруется соответствующей ему антисывороткой. Снижение (потребление) количества антигена по сравнению с введенным в реакцию свидетельствует о наличии в исследуемом материале антител к этому антигену. Исходя из количества потребленного антигена рассчитывается количество антител в единице объема (массы) исследуемого материала.
При постановке РПАТ решается обратная задача.