Реакции иммунитета их практическое значение
Реакции
иммунитета – это реакции специфического
взаимодействия (связывания) антигена
и антитела или антигена и сенсибилизированного
Т-лимфоцита.
Эти
реакции протекают in
vitro
(в пробирке) и in
vivo
(в живом организме).
В
этих реакциях участвует сыворотка
(serum),
поэтому они называются серологическими.
Реакции
иммунитета используются для диагностики
инфекционных заболеваний. При
этом неизвестный компонент определяется
по известному компоненту, что основано
на специфичности взаимодействия антигена
с антителом. Если известно
антитело,
то можно выявить
(обнаружить) неизвестный антиген.
Если же известен
антиген, то
по нему можно обнаружить
неизвестные антитела.
Таким образом,
реакции иммунитета используются:
1)
для серологической
диагностики (серодиагностики) заболеваний
— обнаружение
в сыворотке крови больных людей антител
к определенному возбудителю инфекционного
заболевания (известному антигену); если
в сыворотке крови больного человека
присутствуют антитела к какому-либо
возбудителю, то именно этот возбудитель
и вызвал данное инфекционное заболевание;
2)
для серологической
идентификации (сероидентификации)
микробов — для
установления вида возбудителя заболевания
при помощи иммунных диагностических
сывороток (известных антител); если
антитела связывают возбудителя,
выделенного от больного человека, то
этот микроб идентичен тому, которым
иммунизировали животного при получении
иммунной диагностической сыворотки.
Реакции иммунитета
протекают в 2 фазы:
1)
специфическая
фаза –
соединение активного центра антитела
с детерминантной группой антигена с
образованием комплексов антиген-антитело;
эта фаза протекает быстро, но нет видимого
эффекта;
2)
неспецифическая
фаза –
появление видимого
эффекта
взаимодействия антигена и антитела –
выпадение осадка
(агглютинация) или помутнение
(преципитация),
что позволяет увидеть
образование комплексов
антиген-антитело
и сделать вывод о соответствии
антигена и антитела друг другу.
К
реакциям иммунитета относятся реакция
агглютинации (РА), реакция преципитации
(РП), реакция связывания комплемента
(РСК).
Реакция агглютинации.
Реакция
агглютинации
– это склеивание и выпадение в осадок
микробных или других клеток (эритроцитов)
под действием антител в присутствии
электролита. Видимый эффект реакции
(феномен агглютинации) – образование
осадка, который называется агглютинатом.
Эту
реакцию используют для серодиагностики
и сероидентификации.
РА используют для
серодиагностики
(обнаружение антител в сыворотке крови
больных) брюшного
тифа и паратифа
(реакция Видаля), бруцеллеза
(реакция Райта), туляремии
и лептоспироза.
РА используют для сероидентификации
(определения вида возбудителя, выделенного
от больного) при кишечных
инфекциях, коклюше, холере
и др.
Компоненты
реакции:
1.
Антиген
(агглютиноген) – это
целые (не разрушенные) микробные или
другие клетки (корпускулярный,
нерастворимый
антиген).
Агглютиногены
– это взвесь
живых
или убитых
микробных клеток или других каких-либо
клеток. Антигены могут быть как
неизвестными, так и известными. Неизвестный
агглютиноген – это микробная культура,
выделенная из организма больного,
которую необходимо определить. Известный
антиген – диагностикум
– диагностический препарат — взвесь
убитых
микробов известного
вида в
физиологическом растворе. Эта взвесь
мутная
(непрозрачная),
т.к. микробные клетки не растворяются,
а остаются целыми. Известный агглютиноген
будет использоваться для обнаружения
неизвестных антител в сыворотке крови
больных.
2.
Антитело
(агглютинин)
– находится в сыворотке крови. Антитела
также могут быть как неизвестными, так
и известными. Неизвестные антитела,
которые нужно определить, находятся в
сыворотке крови больного
человека.
Известные антитела находятся в иммунных
диагностических сыворотках,
которые называются агглютинирующими
сыворотками.
Они используются для сероидентификации,
т.е. для определения неизвестного
антигена – вида микробной культуры.
3.
Электролит
– 0,9% раствор хлорида натрия.
Получение
диагностикума.
Выращенную
на скошенном агаре чистую культуру
возбудителя известного вида (например,
возбудителя брюшного тифа) смывают 3-4
мл изотонического раствора, помещают
в стерильную пробирку, каким-либо
способом убивают микробы (например,
кипячением и определяют густоту (должно
быть 3 млрд. микробных клеток в 1 мл). Если
микробные клетки убивают высокой
температурой, то получают О-диагностикум
(О-антиген), если же ее обрабатывают
формалином, то получают Н-диагностикум
(Н-антиген).
Примеры
диагностикумов:
сальмонеллезный
диагностикум, бруцеллезный диагностикум,
туляремийный диагностикум.
Получение
агглютинирующих сывороток.
Животным
(чаще кроликам) 5 – 7 раз через промежутки
времени парентерально вводят в
возрастающих дозах микробные диагностикумы
(проводят
гипериммунизацию),
а затем у них отбирают сыворотку крови,
в которой содержатся антитела к тем
микробам, из которых приготовлен
диагностикум. Если иммунизацию проводят
О-диагностикумом, то получают
О-агглютинирующие сыворотки (содержат
О-антитела), если Н-диагностикумом –
Н-агглютинирующие сыворотки.
Агглютинирующие
сыворотки могут быть неадсорбированными
или нативными и адсорбированными.
Неадсорбированные
сыворотки
содержат групповые антитела к нескольким
близкородственным видам микробов.
Адсорбированные
сыворотки содержат
антитела к одному или нескольким
антигенам одного вида микроба. Если
сыворотки содержат антитела только к
одному антигену, они называются
монорецепторными
или моновалентными,
если к
нескольким антигенам – групповыми
адсорбированными
сыворотками.
Примеры
агглютинирующих сывороток: сальмонеллезная
монорецепторная Н-агглютинирующая
сыворотка, сальмонеллезная групповая
адсорбированная О-агглютинирующая
сыворотка, противохолерная О-агглютинирующая
сыворотка и др.
Титр
агглютинирующей сыворотки – наибольшее
разведение сыворотки, при котором еще
обнаруживается реакция агглютинации
с антигеном (титр зависит от количества
антител в крови: чем больше антител, тем
выше титр сыворотки).
Способы постановки
РА.
1.
Ориентировочная (пластинчатая) РА
– проводится на стекле. На предметное
стекло наносят 2 капли сыворотки и 1
каплю изотонического раствора. В одну
из капель сыворотки и в каплю изотонического
раствора петлей вносят микробную
культуру и перемешивают. Капля
изотонического раствора с
микробами
– контроль
антигена,
капля сыворотки
без микробов
– контроль
антитела,
капля сыворотки
с микробами
– опыт.
Если в сыворотке имеются антитела,
соответствующие микробным антигенам,
которые с ней смешиваются, то антитела
и антигены будут специфически связываться
друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной
капле появятся хлопья агглютината.
Контроль антигена должен быть мутным,
а контроль антитела – прозрачным. Учет
результатов реакции проводится по
появлению хлопьев агглютината.
Если выпадают хлопья – реакция
положительна, т.е. антиген соответствует
антителу и по антигену можно определить
антитело или наоборот. Если остается
помутнение – реакция отрицательная.
2.
Развернутая
реакция агглютинации – проводится
в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные
разведения сыворотки крови больного
человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок
наливают по 1 мл изотонического раствора
хлорида натрия. В первую пробирку вносят
1 мл сыворотки крови больного в разведении
1:50, перемешивают и получают разведение
1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят
во вторую пробирку и получают разведение
1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для
контроля антигена и сыворотки. В контроль
сыворотки добавляют только сыворотку
в разведении 1:50, в контроль антигена –
только антиген. Во все остальные пробирки
добавляют 0,1 мл антигена — диагностикума
(О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат
при 37С
на 18-20 часов. Учет
результатов реакции проводят по
характеру, количеству образовавшегося
осадка (агглютината) и степени мутности.Учет проводят
только при следующих результатах в
контролях: контроль сыворотки –
прозрачный, контроль антигена – мутный.
О-антитела дают мелкозернистый осадок.
Н-антитела – крупнозернистый. По
последней пробирке, в которой еще видна
реакция агглютинации, устанавливают
диагностический
титр.
При
серодиагностике
заболеваний важно не просто обнаружить
специфические антитела к определенному
возбудителю, но и выявить их количество,
т.е. установить
такой титр антител, когда
можно говорить о наличии заболевания,
вызванного этим возбудителем.
Этот титр и называется диагностическим
титром.
Например, для диагностики брюшного тифа
нужно выявить титр антител – 1:400, но не
меньше. Еще более точные результаты
дает выявление
нарастания антител в парных сыворотках.
Сыворотку
больного отбирают в начале заболевания
и через 3 – 5 или более дней. Если титр
антител возрастает не менее, чем в 4
раза, следовательно, можно говорить о
текущем
заболевании.
Если
развернутая реакция агглютинации
ставится для сероидентификации, то
используют агглютинирующие диагностические
сыворотки, разведенные до титра или до
половины их титра. РА считается
положительной, если агглютинация
обнаруживается в разведении, близком
к титру диагностической сыворотки.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
Реакции иммунитета — это реакции между антигеном и антителом или между антигеном и сенсибилизированными лимфоцитами, которые происходят в живом организме и могут быть воспроизведены invitro. В силу высокой чувствительности и строгой специфичности они нашли широкое применение при диагностике инфекционных болезней.
Реакции антигена с антителом называются серологическими (от лат. serum— сыворотка) или гуморальными (от лат. humor — жидкость). Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоцитами называются клеточными.
Серологические реакции — реакции взаимодействия антигена с антителом протекают в две фазы: первая фаза — специфическая, характеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела (видимого изменения в этой фазе не происходит; вторая фаза — неспецифическая. В этой фазе образовавшийся комплекс антиген — антитело утрачивает растворимость в изотоническом растворе и выпадает в осадок, а может быть видимым визуально. При взаимодействии антител с низкодисперсными антигенами (бактерии, эритроциты) наблюдается феномен агглютинации; при взаимодействии антител с высокодисперсными антигенами (полисахаридами, белками и их комплексами) образуются преципитаты (флокуляты).
РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
В реакции агглютинации (РА) участвуют антитела (агглютинины), содержащиеся в сыворотке крови больного организма, антиген (агглютиноген) — клетки живых или убитых бактерий, возбудителей данной болезни, а неспецифическая фаза осуществляется в присутствии электролита (0,85 %-ного раствора хлорида натрия). Сущность реакции заключается во взаимодействии антитела с антигеном, в результате чего происходит вклеивание микробов с образованием хлопьев, комков, видимых невооруженных глазом. РА характеризуется высокой специфичностью и используется с 1 двоякой целью: а) для диагностики инфекционной болезни путем обнаружения в сыворотке крови больного животного антител к определенному – известному виду микроба (антигену); б) определения вида (типа) выпиленного микроба при помощи заведомо известных агглютинирующих сывороток, содержащих видо- и типоспецифические антитела (агглютинины).
Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровекапельный, кольцевая реакция с молоком, антиглобулиновый тест (реакция) Кумбса, реакция гемагглютинации и др. В ветеринарной практике РА применяется для диагностики бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, лептоспироза, листериоза и многих других болезней, а также для идентификации выделенных возбудителей.
В последние годы широко применяют реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). По своей высокой чувствительности и специфичности РНГА заняла одно из ведущих мест в серодиагностике. Сущность ее заключается в том, что белковые молекулы антигена соответствующего возбудителя предварительно адсорбируют на обработанных танином эритроцитах барана. Затем ставят реакцию путем смешения сенсибилизированных эритроцитов с сывороткой крови больных животных. При наличии в сыворотке специфических антител на данный антиген происходит агглютинация эритроцитов — реакция положительна. РНГА ставят при диагностике микоплазмоза, сальмонеллезов, вирусных инфекций.
РЕАКЦИЯ КУМБСА
Реакция Кумбса (РК, антиглобулиновый метод) позволяет выявить неполные антитела (агглютиноиды, блокирующие). Неполные антитела одновалентны, в связи с чем они тормозят образование агглютината в РА. Кумбс (1945) предложил эффективный метод выявления неполных антител. Метод основан на применении алтиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). Антиглобулиновую сыворотку получают иммунизацией кроликов сывороткой крови или глобулиновой фракцией животного того вида, у которого исследуют наличие неполных антител.
Имеется два варианта постановки реакции Кумбса: прямой и непрямой. Прямой метод заключается в том, что берут эритроциты исследуемого больного (иммунизированного) животного, которые
на поверхности содержат адсорбированные неполные антитела. При добавлении антиглобулиновой сыворотки к таким эритроцитам invitro происходит их агглютинация. Непрямой вариант реакции Кумбса основан на исследовании сыворотки крови больного животного, содержащей неполные антитела. Сыворотку смешивают с эритроцитами здорового животного для адсорбции ими неполных антител. Затем к эритроцитам добавляют антиглобулиновую сыворотку, которая вступает в реакцию с неполными антителами, в результате происходит агглютинация эритроцитов.
РК используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в бактериальном варианте, т. е. вместо эритроцитов используют бактерии бруцелл.
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ
Для постановки реакции преципитации (РП) используют высокодисперсный антиген в виде прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. При соединении антигена (преципитиногена) с антителом (преципитином) в присутствии электролита (0,85 %-ного раствора NaCl) происходит взаимодействие с образованием видимых агрегатов (помутнение, хлопья) частиц, которые постепенно осаждаются на дно пробирки. Осадок получил название «преципитат». РП протекает в две фазы. В первой происходит соединение антигена с антителом, во второй — коагуляция (преципитация) специфического комплекса антиген — антитело в растворе электролита с образованием видимых частиц (серо-белые хлопья, помутнение). Поиск антигена в исследуемом материале проводят с заведомо известной преципитирующей сывороткой.
РП высокоспецифична и чувствительна, позволяет обнаружить антиген в разведении до 1:10 млн. Применяется для исследования кожевенного сырья на сибирскую язву, идентификации некоторых вирусов, бактерий, при установлении фальсификации мяса и др.
Антиген для реакции получают путем экстракции из микробных культур, тканей и органов павших животных, а также из кожевенного сырья. Антитела получают путем гипериммунизации животных антигенами.
Существуют различные методы постановки РП. В ветеринарной практике чаще всего применяют реакцию кольцепреципитации и диффузионной преципитации в агаровом геле.
Реакция кольцепреципитации (реакция Асколи) применяется для обнаружения сибиреязвенного антигена в животном сырье (кожи, кусочки внутренних органов, мышцы). Антиген получают путем экстрагирования в физрастворе горячим или холодным способом. Полученный антиген наслаивают тонкой стеклянной пипеткой на преципитирующую сыворотку, либо сыворотку подслаивают под антиген в узких пробирках. При положительном результате через несколько минут на границе соприкосновения антигена и антитела появляется преципитат, напоминающий серо-белое кольцо или диск.
Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП). Эта реакция считается наиболее чувствительной и эффективной при иммунологических исследованиях. В отличие от жидкой среды, где образуется одна линия (полоска) преципитации, в условиях геля.
I реагенты (антигены и антитела) диффундируют навстречу друг другу и на границе соприкосновения (встречи) образуются белые линии преципитата. Существует несколько методов постановки РП.
Метод прямой одномерной диффузии РДП заключается в том, что на столбик или пластинку агара, содержащего специфическую преципитирующую сыворотку, наслаивают антиген в физрастворе, который медленно диффундирует в агар. В результате взаимодействия образуются полоски преципитата, соответствующие реагирующим антигену — антителу.
Метод двойной (встречной) двухмерной диффузии, предложенный Оухтерлони. Реакцию ставят в чашках Петри или на предметных стеклах, залитых 1 %-нымнейтральным агаром. В застывшем агаре с помощью пробойника вырезают по трафаретке луночки размером 0,6 мм.
Обычно в центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в окружающие лунки испытуемые (экстракты) и контрольные антигены. Оба компонента диффундируют во встречном направлении в слое агарового геля. На месте встречи специфических антигена и антитела образуется преципитат серо-белого цвета в виде полосок, линий. При ‘исследовании набора антител в исследуемых сыворотках в центральную лунку вносят известный антиген, а в окружающие — соответствующие сыворотки.
В 1953 г. Окли и Фултроп предложили сравнительно простой метод постановки РДП, заключающийся в том, что каждый реагент (антиген и антитело) смешивают с агаром отдельно и поочередно вносят в пробирку. На границе слоев в пробирке при положительном результате образуется полоска преципитата.
Радиальнаяиммунодиффузия (РИД). На поверхность стекла или пластика наливают расплавленный агар, предварительно смешанный с высокоактивной антисывороткой. В застывшем агаре делают лунку (обычно до 2 мм в диаметре) и заполняют ее точным количеством испытуемого антигена. Опыт проводят во влажной камере при постоянной температуре. Антиген диффундирует из лунок радиально в агаровый гель, смешанный с антителами, в результате образуются кольца преципитации. Диаметр этих колец прямо пропорционален концентрации антигена.
РИД используют для определения содержания растворимых антигенов, иммуноглобулинов всех классов, а также различных токсинов и ферментов.
РЕАКЦИЯ ФЛОКУЛЯЦИИ
Реакцию флокуляции открыл Рамон в 1922 г. Он установил, что при смешивании антидифтерийной сыворотки и токсина (или анатоксина) в пробирке, где произошла нейтрализация токсина, появляется помутнение, затем образуются хлопья, которые оседают на дно. Этот феномен получил название реакции флокуляции. Методика опыта заключается в следующем. В ряд пробирок с постоянной дозой токсина (например, 1 мл) вносят нарастающее количество антитоксической сыворотки. Опыт ведут при 37 °С. В отдельных пробирках через некоторое время образуется опалесценция или мелкие хлопья, постепенно выпадающие в осадок при просветлении жидкости. Смесь, в которой раньше всего появилась флокуляция, соответствует нейтральной Смеси, т. е. нейтрализации всего количества взятого токсина (инициальная флокуляция). Следовательно, если известна сила токсина, которая может быть установлена с помощью сыворотки с определенным содержанием антитоксических единиц, то можно выяснить количество антитоксина и в неизвестной испытуемой сыворотке.
Количество анатоксина (например, столбнячного), дающее в смеси с 1 АЕ сыворотки инициальную флокуляцию, называют одной иммуногенной единицей (1 ИЕ). Сила (титр) антитоксической сыворотки характеризуется условно принятой антитоксической единицей (АЕ). АЕ противостолбнячной сыворотки считается наименьшее количество, нейтрализующее 1000 DLM столбнячного токсина.