Реакции иммунитета реакция агглютинации реакция преципитации
Цель: Владеть техникой постановки реакции агглютинации и реакции преципитации для диагностики инфекционных заболеваний.
Модуль 1.Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.
Содержательный модуль 9.Реакции иммунитета.
Тема 16: Реакция агглютинации. Реакция преципитации.
Актуальность темы.Под иммунитетом подразумевают невосприимчивость организма к инфекционным и неинфекционным агентам (патогенных микроорганизмов, чужеродных белков и др. веществ). Эти агенты получили названия антигенов. Иммунитет бывает врожденным и приобретенным. Врожденный – когда формируются тканевые и гуморальные защитные приспособления, обуславливающие невосприимчивость к инфекционным заболеваниям, передающимся по наследству.
Приобретенный – осуществляется иммунной системой организма в виде выработки антител или накопления сенсибилизированных лимфоцитов. Он подразделяется на естественный и искусственный. По механизму действия разделяется на активный и пассивный. Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген.
Основной функцией иммунной системы, которая состоит из лимфоидной ткани, является распознавание чужеродных агентов (антигенов) и обезвреживание их.
Антигены могут попадать в организм через дыхательные пути, пищеварительный тракт, через кожные и слизистые покровы. Каждый антиген стимулирует образование особых белковых веществ – антител.
Антигены подразделяются на полноценные и неполноценные (гаптены). Полноценные антигены вызывают полный иммунный ответ. Неполноценные антигены самостоятельно не вызывают иммунного ответа, но иногда приобретают эту способность при конъюгации с высокомолекулярными белковыми носителями. Кроме того, бывают антигены: полугаптены, проантигены, гетероантигены и изоантигены.
Антитела представляют собой иммуноглобулины сыворотки крови человека или животного. Образуются антитела после перенесенной инфекции, и в результате иммунизации ослабленными или убитыми бактериями, риккетсиями, вирусами, токсинами и другими агентами. Антитела – белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам. По структуре и иммунобиологическим свойствам иммуноглобулины подразделяются на 5 классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Нормальные антитела обнаруживают у людей и животных не иммунизированных. Специфические антитела образуются в результате перенесенной инфекции или же иммунизации.
Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими. Серологические реакции отличаются высокой специфичностью и применяются при диагностике многих инфекционных заболеваний. Различают реакции агглютинации и преципитации.
1. Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии антигена (агглютиногена) и антитела (агглютинина), при котором происходит склеивание и выпадение в осадок микробных тел в присутствии электролита. Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации.
Наибольшее значение имеют:
— Макроскопическая (развернутая) агглютинация в пробирках. К сыворотке больного добавляют взвесь микробов (диагностикум) и через 1 час в термостате при температуре 37 градусов отмечают разведение (титр) сыворотки, при котором произошла реакция. Положительной считают реакцию агглютинации тогда, когда на дне пробирки образуется осадок с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Этот осадок называется агглютинатом.
По характеру агглютината различают мелкозернистую (О) и крупнозернистую (Н) агглютинацию. Для выявления мелкозернистого агглютината пользуются агглютиноскопом. Учет результатов начинают с контрольных пробирок. Последнее разведение сыворотки, в которой наблюдается агглютинация, считают ее титром.
Цель реакции: обнаружение антител в сыворотке больного.
— Микроскопическая (ускоренная)ориентировочная агглютинация на стекле. К капле диагностической иммунной сыворотки вносят каплю бактериальной культуры и равномерно перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре через 5-10 минут. Затем производят учет. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают скопление бактерий в виде зернышек или хлопьев. Цель реакции: определение вида возбудителя по известной диагностической сыворотке.
— Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты барана способны адсорбировать на своей поверхности антигены. Под воздействием специфических антител, эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне гемагглютинат. Реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РНГА позволяет обнаружить минимальное количество антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. Эту реакцию применяют при диагностики многих инфекционных заболеваний (брюшного и сыпного тифа, паратифов, туберкулеза и др.).
2. Реакция преципитации (РП)–осаждение комплекса антиген-антитело. Основным отличием РП от РА является то, что при РА применяется корпускулярный антиген, а при РП – антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы. В этой реакции антиген называется преципитиноген, а антитела – преципитины. Реакцию ставят в пробирках наслоением раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе
этих растворов образуется кольцо преципитата. Если в качестве антигена используют прокипяченные и профильтрованные экстракты органов и тканей, реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, которую ставят при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии и др.).
Широкое распространение получили реакции преципитации в агаре: метод простой диффузии, метод двойной диффузии.
Разновидностью преципитации является реакция флокуляции – для определение активности анатоксина или антитоксической сыворотки. Кроме того, можно использовать эту реакцию для определения токсигенности штаммов Corynebacterium diphtheriae.
Конкретные цели:
· Объяснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;
· Описать структуру антигенов, в том числе антигенов микроорганизмов;
· Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);
· Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;
· Описать механизм реакции агглютинации;
· Описать механизм реакции преципитации.
Уметь:
· Пояснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;
· Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);
· Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;
· Трактовать результаты реакции агглютинации;
· Трактовать результаты реакции преципитации;
· Анализировать полученные результаты.
Теоретические вопросы:
1. Определение понятия «антигены», «антитела».
2. Роль антигенов как индукторов иммунного ответа.
3. Структура антител (разных классов иммуноглобулинов).
4. Механизм взаимодействия антител с антигенами.
5. Реакции иммунитета, их роль в иммунном ответе и диагностике инфек-ционных болезней.
6. Механизм реакции агглютинации.
7. Механизм реакции преципитации.
Практические задания, которые выполняются на занятии:
1. Постановка реакции агглютинации для выявления антител в сыворотке больного.
2. Постановка реакции микроагглютинации на стекле с диагностическими сыворотками для идентификации чистой культуры бактерий.
3. Оценка результатов реакции агглютинации.
4. Постановка реакции преципитации для выявления антигена бактерий.
5. Оценка результатов реакции преципитации.
6. Оценка результатов реакции непрямой гемагглютинации.
7. Оформление протокола.
Литература:
1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и имму-нологией.– Киев: Высшая школа, 1992.- 431с.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина, 1998.- 336с.
3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.
5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.
6. Конспект лекции.
Дополнительная литература:
1. Титов М.В. Инфекционные болезни.- К., 1995.– 321с.
2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.– М.: Медицина, 1990.- 559с.
3. БМЭ, Т. 1,2,7.
Методическая
рекомендация для студентов к практическому
занятию 16
Тема: Реакции
иммунитета:
реакция
агглютинации, реакция преципитации.
Цель:
Владеть техникой постановки реакции
агглютинации и реакции преципитации
для диагностики инфекционных заболеваний.
Модуль
1. Морфология
и физиология микроорганизмов. Инфекция.
Иммуни-тет.
Содержательный
модуль 9. Реакции
иммунитета.
Актуальность
темы. Под
иммунитетом
подразумевают невосприимчивость
организма к инфекционным и неинфекционным
агентам (патогенных микроорганизмов,
чужеродных белков и др. веществ). Эти
агенты получили названия антигенов.
Иммунитет бывает врожденным и
приобретенным. Врожденный
– когда формируются тканевые и гуморальные
защитные приспособления, обуславливающие
невосприимчивость к инфекционным
заболеваниям, передающимся по наследству.
Приобретенный
– осуществляется иммунной системой
организма в виде выработки антител или
накопления сенсибилизированных
лимфоцитов. Он подразделяется на
естественный
и искусственный.
По механизму действия разделяется на
активный и
пассивный.
Во всех иммунологических реакциях
основным компонентом является антиген.
Основной функцией
иммунной системы, которая состоит из
лимфоидной ткани, является распознавание
чужеродных агентов (антигенов) и
обезвреживание их.
Антигены могут
попадать в организм через дыхательные
пути, пищеварительный тракт, через
кожные и слизистые покровы. Каждый
антиген стимулирует образование особых
белковых веществ – антител.
Антигены
подразделяются на полноценные и
неполноценные (гаптены). Полноценные
антигены
вызывают полный иммунный ответ.
Неполноценные
антигены
самостоятельно не вызывают иммунного
ответа, но иногда приобретают эту
способность при конъюгации с
высокомолекулярными белковыми носителями.
Кроме того, бывают антигены: полугаптены,
проантигены, гетероантигены и изоантигены.
Антитела
представляют собой иммуноглобулины
сыворотки крови человека или животного.
Образуются антитела после перенесенной
инфекции, и в результате иммунизации
ослабленными или убитыми бактериями,
риккетсиями, вирусами, токсинами и
другими агентами. Антитела
– белки иммуноглобулинов по химическому
составу относятся к гликопротеидам. По
структуре и иммунобиологическим
свойствам иммуноглобулины подразделяются
на 5 классов:
IgM,
IgG,
IgA,
IgE,
IgD.
Нормальные
антителаобнаруживают у людей и
животных не иммунизированных.Специфические
антителаобразуются в результате
перенесенной инфекции или же иммунизации.
Реакции взаимодействия
антитела с антигеном называются
серологическими.
Серологические реакции отличаются
высокой специфичностью и применяются
при диагностике многих инфекционных
заболеваний. Различают реакции
агглютинации и преципитации.
1. Реакция
агглютинации (РА)
основана на взаимодействии антигена
(агглютиногена) и антитела (агглютинина),
при котором происходит склеивание и
выпадение в осадок микробных тел в
присутствии электролита. Существуют
различные модификации постановки
реакции агглютинации.
Наибольшее значение
имеют:
— Макроскопическая
(развернутая) агглютинация в пробирках.
К сыворотке больного добавляют взвесь
микробов (диагностикум) и через 1 час в
термостате при температуре 37 градусов
отмечают разведение (титр) сыворотки,
при котором произошла реакция.
Положительной считают реакцию агглютинации
тогда, когда на дне пробирки образуется
осадок с выраженным просветлением
надосадочной жидкости. Этот осадок
называется агглютинатом.
По характеру
агглютината различают мелкозернистую
(О) и крупнозернистую (Н) агглютинацию.
Для выявления мелкозернистого агглютината
пользуются агглютиноскопом. Учет
результатов начинают с контрольных
пробирок. Последнее разведение сыворотки,
в которой наблюдается агглютинация,
считают ее титром.
Цель реакции:
обнаружение антител в сыворотке больного.
— Микроскопическая
(ускоренная)
ориентировочная
агглютинация на стекле.
К капле диагностической иммунной
сыворотки вносят каплю бактериальной
культуры и равномерно перемешивают.
Реакция протекает при комнатной
температуре через 5-10 минут. Затем
производят учет. При положительной
реакции в капле с сывороткой отмечают
скопление бактерий в виде зернышек или
хлопьев. Цель реакции: определение вида
возбудителя по известной диагностической
сыворотке.
— Реакция
непрямой (пассивной) гемагглютинации
(РНГА).
Сущность этой реакции заключается в
том, что эритроциты барана способны
адсорбировать на своей поверхности
антигены. Под воздействием специфических
антител, эритроциты склеиваются и
выпадают в осадок, образуя на дне
гемагглютинат. Реакция отличается
высокой чувствительностью и специфичностью.
РНГА позволяет обнаружить минимальное
количество антител и неполноценные
антигены полисахаридной природы. Эту
реакцию применяют при диагностики
многих инфекционных заболеваний
(брюшного и сыпного тифа, паратифов,
туберкулеза и др.).
2. Реакция
преципитации (РП)
–
осаждение
комплекса антиген-антитело. Основным
отличием РП от РА является то, что при
РА применяется корпускулярный антиген,
а при РП – антиген представляет собой
коллоидное вещество белковой или
полисахаридной природы. В этой реакции
антиген называется преципитиноген, а
антитела – преципитины. Реакцию ставят
в пробирках наслоением раствора антигена
на иммунную сыворотку. При оптимальном
соотношении антигена и антител на
границе
этих
растворов образуется кольцо преципитата.
Если в качестве антигена используют
прокипяченные и профильтрованные
экстракты органов и тканей, реакция
называется реакцией термопреципитации
(реакция Асколи, которую ставят при
диагностике сибирской язвы, чумы,
туляремии и др.).
Широкое распространение
получили реакции преципитации в агаре:
метод простой
диффузии, метод двойной диффузии.
Разновидностью
преципитации является реакция
флокуляции
– для определение активности анатоксина
или антитоксической сыворотки. Кроме
того, можно использовать эту реакцию
для определения токсигенности штаммов
Corynebacterium
diphtheriae.
Конкретные цели:
Объяснить
роль антигенов, как индукторов иммунного
ответа;Описать
структуру антигенов, в том числе
антигенов микроорганизмов;Описать
структуру антител (разных классов
иммуноглобулинов);Проанализировать
механизм взаимодействия антител с
антигенами;Описать
механизм реакции агглютинации;Описать
механизм реакции преципитации.
Уметь:
Пояснить
роль антигенов, как индукторов иммунного
ответа;Описать
структуру антител (разных классов
иммуноглобулинов);Проанализировать
механизм взаимодействия антител с
антигенами;Трактовать
результаты реакции агглютинации;Трактовать
результаты реакции преципитации;Анализировать
полученные результаты.
Теоретические
вопросы:
Определение
понятия «антигены», «антитела».Роль
антигенов как индукторов иммунного
ответа.Структура
антител (разных классов иммуноглобулинов).Механизм
взаимодействия антител с антигенами.Реакции
иммунитета, их роль в иммунном ответе
и диагностике инфек-ционных болезней.Механизм
реакции агглютинации.Механизм
реакции преципитации.
Практические
задания, которые выполняются на занятии:
Постановка
реакции агглютинации для выявления
антител в сыворотке больного.Постановка
реакции микроагглютинации на стекле
с диагностическими сыворотками для
идентификации чистой культуры бактерий.Оценка
результатов реакции агглютинации.Постановка
реакции преципитации для выявления
антигена бактерий.Оценка
результатов реакции преципитации.Оценка
результатов реакции непрямой
гемагглютинации.Оформление
протокола.
Литература:
1.
Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология
с вирусологией и имму-нологией.– Киев:
Высшая школа, 1992.- 431с.
2.
Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П.,
Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина,
1998.- 336с.
3.
Медицинская микробиология /Под редакцией
В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.–
768с.
4.
Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская
микробиология, иммуноло-гия и вирусология
/Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.:
«Специальная литература», 1998.- 592с.
5.
Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б.
Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб.
и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.
6.
Конспект лекции.
Дополнительная
литература:
1.
Титов М.В. Инфекционные болезни.- К.,
1995.– 321с.
2.
Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.–
М.: Медицина, 1990.- 559с.
3.
БМЭ, Т. 1,2,7.
Краткие
методические указания для работы на
практическом занятии.
В начале занятия
проводится проверка уровня подготовки
студентов к занятию. Самостоятельная
работа состоит из:
а) постановки
реакции агглютинации для выявления
антител в сыво-ротке больного и оценки
результатов реакции;
б) постановки
реакции микроагглютинации на стекле и
оценки резуль-татов реакции;
в) постановки
реакции преципитации и оценки результатов
реакции;
г) оценки результатов
реакции непрямой гемагглютинации.
После
анализа результатов реакций, записывают
в протокол.
В конце занятия
проводится оформление протокола,
тестовый контроль и анализ результатов
самостоятельной работы каждого студента.
ГЛАВА 13 ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
13.1. Реакции антиген-антитело и их применение
При
введении антигена в организме образуются антитела. Антитела
комплементарны антигену, вызвавшему их синтез, и способны с ним
связываться. Связывание антигенов с антителами состоит из двух фаз.
Первая фаза — специфическая, при которой происходит быстрое связывание
антигенной детерминанты с активным центром Fab-фрагмента антител.
Следует отметить, что связывание обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами,
водородными и гидрофобными взаимодействиями. Прочность связи
определяется степенью пространственного соответствия активного центра
антитела и эпитопа антигена. После специфической фазы наступает более
медленная — неспецифическая, которая проявляется видимым физическим
явлением (например, образованием хлопьев при агглютинации и др.).
Иммунные
реакции — это взаимодействие между антителами и антигенами, причем эти
реакции специфичны и обладают высокой чувствительностью. Они широко
используются в медицинской практике. С помощью иммунных реакций можно
решить следующие задачи:
• определение
неизвестных антител по известным антигенам (антигенный диагностикум).
Такая задача стоит, когда необходимо определить в сыворотке крови
больного антител к возбудителю (серодиагностика). Нахождение антител
позволяет подтвердить диагноз;
• определение
неизвестных антигенов по известным антителам (диагностическая
сыворотка). Это исследование проводят при идентификации культуры
возбудителя, выделенной из материала больного (серотипирование), а также
при обнаружении
антигенов микробов и их токсинов в
крови и других биологических жидкостях. Существует много разновидностей
иммунных реакций, различающихся по технике постановки и регистрируемому
эффекту. Это реакции агглютинации (РА), преципитации (РП), реакции с
участием комплемента (РСК), реакции с использованием меченых компонентов
(РИФ, ИФА, РИА).
13.2. Реакция агглютинации
Реакция
агглютинации (РА) — это иммунная реакция взаимодействия антигена с
антителами в присутствии электролитов, причем антиген находится в
корпускулярном состоянии (эритроциты, бактерии, частицы латекса с
адсорбированными антигенами). При агглютинации происходит склеивание
корпускулярных антигенов антителами, что проявляется образованием
хлопьевидного осадка. Образование хлопьев происходит за счет того, что
антитела имеют два активных центра, а антигены поливалентны, т.е. имеют
несколько антигенных детерминант. РА применяют для идентификации
возбудителя, выделенного из материала больного, а также для обнаружения в
сыворотке крови больного антител к возбудителю (например, реакции Райта
и Хеддлсона при бруцеллезе, реакция Видаля при брюшном тифе и
паратифах).
Самый простой способ постановки РА —
реакция на стекле, это ориентировочная РА, которая применяется для
определения возбудителя, выделенного от больного. При постановке реакции
на предметное стекло наносят диагностическую агглютинирующую сыворотку
(в разведении 1:10 или 1:20), затем вносят культуру от больного. Реакция
положительная, если в капле появляется хлопьевидный осадок. Рядом
ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида.
Если диагностическая агглютинирующая сыворотка неадсорбированная1,
то ее разводят (до титра — разведения, до которого должна происходить
агглютинация), т.е. ставят развернутую РА в пробирках с увеличивающимися
1
Неадсорбированная агглютинирующая сыворотка может агглютинировать
родственные бактерии, имеющие общие (перекрестно реагирующие) антигены.
Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из
которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их
родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела,
специфичные только к данной бактерии.
разведениями
агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси
возбудителя, выделенного от больного. Агглютинацию учитывают по
количеству осадка и степени просветления жидкости в пробирках. Реакцию
считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении,
близком к титру диагностической сыворотки. Реакция сопровождается
контролями: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия
хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе —
равномерно мутной, без осадка.
Для определения в
сыворотке крови больного антител к возбудителю используют развернутую
РА. При ее постановке в пробирках разводят сыворотку крови больного и
добавляют в пробирки равное количество взвеси диагностикума (взвесь
убитых микробов). После инкубации определяют наибольшее разведение
сыворотки, при котором произошла агглютинация, т.е. образовался осадок
(титр сыворотки). При этом реакция агглютинации с О-диагностикумом
(бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген)
происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с
Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие
термолабильный жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает
быстрее.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА
или РПГА) является разновидностью РА. Этот метод обладает высокой
чувствительностью. С помощью РНГА можно решить две задачи: определить
антитела в сыворотке крови больного, к которой добавляют антигенный
эритроцитарный диагностикум, представляющий собой эритроциты, на которых
адсорбированы известные антигены; определить наличие антигенов в
исследуемом материале. В этом случае реакцию иногда называют реакцией
обратной непрямой гемагглютинацией (РОНГА). При постановке к
исследуемому материалу добавляют антительный эритроцитарный диагностикум
(эритроциты с адсорбированными на их поверхности антителами).
Эритроциты в этой реакции выполняют роль носителей и пассивно
вовлекаются в образование иммунных агрегатов. При положительной реакции
пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с
фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты
скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную
«пуговку» с резко очерченными краями.
Реакция коагглютинации используется для определения клеток возбудителя (антигенов) с помощью антител, адсорбированных на Staphylococcus aureus, содержащем
белок А. Белок А обладает сродством к Fc-фрагменту иммуноглобулинов.
Благодаря этому антитела связываются с стафилококком опосредованно через
Fc- фрагмент, а Fab-фрагменты ориентированы наружу и способны
взаимодействовать с соответствующими микробами, выделенными от больных.
При этом образуются хлопья.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется
при диагностике вирусных инфекций, причем только инфекций, вызываемых
гемагглютинирующими вирусами. Эти вирусы содержат на своей поверхности
белок — гемагглютинин, который ответствен за реакцией гемагглютинации
(РГА) при добавлении к вирусам эритроцитов. РТГА заключается в
блокировании антителами вирусных антигенов, в результате чего вирусы
теряют способность агглютинировать эритроциты.
Реакция Кумбса — РА
для определения неполных антител. При некоторых инфекционных
заболеваниях, например при бруцеллезе, в сыворотке крови больного
циркулируют неполные антитела к возбудителю. Неполные антитела называют
блокирующими, так как они имеют один антигенсвязывающий участок, а не
два, как полноценные антитела. Поэтому при добавлении антигенного
диагностикума неполные антитела связываются с антигенами, но не
склеивают их. Для проявления реакции добавляют антиглобулиновую
сыворотку (антитела к иммуноглобулинам человека), которая приведет к
агглютинации иммунных комплексов (антигенный диагностикум + неполные
антитела), образовавшихся в первой стадии реакции.
Непрямую
реакцию Кумбса применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У
некоторых таких больных обнаруживают неполные одновалентные антирезусные
антитела. Они специфически взаимодействуют с резусположительными
эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Поэтому в систему
антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют
антиглобулиновую сыворотку, что вызывает агглютинацию эритроцитов. С
помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные
с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например
гемолитическую болезнь новорожденных, обусловленную резус-конфликтом.
РА для определения групп крови основана
на агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки к антигенам
групп крови А(II), B(III). Контролем являются сыворотка, не содержащая
антител, т.е. сыворотка AB(IV) группы крови, и антигены эритроцитов
групп А(П) и B(III). В качестве отрицательного контроля применяют
эритроциты группы 0(I), поскольку они не имеют антигенов.
Для
определения резус-фактора используют антирезусные сыворотки (не менее
двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов
резус-антигена происходит агглютинация этих клеток.
13.3. Реакция преципитации
РП
— это иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами в
присутствии электролитов, причем антиген находится в растворимом
состоянии. При преципитации происходит осаждение растворимых антигенов
антителами, что проявляется помутнением в виде полос преципитации.
Образование видимого преципитата наблюдается при смешивании обоих
реагентов в эквивалентных соотношениях. Избыток одного из них снижает
количество осаждающихся иммунных комплексов. Существуют различные
способы постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации ставится
в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят
иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый антиген. При
положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо
молочного цвета. Реакция кольцепреципитации, с помощью которой
определяют наличие антигенов в органах и тканях, экстракты которых
кипятят и фильтруют, называется реакцией термопреципитации (реакция
Асколи для определения термостабильного сибиреязвенного антигена).
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Эта
реакция проводится в агаровом геле. В слое геля равномерной толщины на
определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки и заполняют их
антигеном и иммунной сывороткой соответственно. После этого антигены и
антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют
иммунные комплексы, которые преципитируют в геле и становятся видимыми
как линии преци-
питации. Эту реакцию
можно использовать для определения неизвестных антигенов или антител, а
также для проверки сходства между различными антигенами: если антигены
идентичны, линии преципитации сливаются, если антигены неидентичны,
линии преципитации пересекаются, если антигены частично идентичны,
формируется шпора.
Реакция радиальной иммунодиффузии. В
расплавленный агаровый гель добавляют антитела и наносят гель
равномерным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и вносят в них
стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Во время
инкубации антигены радиально диффундируют из лунки и, встретившись с
антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке
сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра
кольца преципитации. Этот метод используется для определения антигенов
или антител в исследуемом растворе (например для определения
концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови).
Иммуноэлектрофорез. Предварительно
электрофоретически разделяют смесь антигенов, затем в канавку, идущую
вдоль направления движения белков, вносят преципитирующую антисыворотку.
Антигены и антитела диффундируют в гель навстречу друг другу;
взаимодействуя, они образуют дугообразные линии преципитации.
Реакция флоккуляции (по
Рамону) — разновидность реакции преципитации, которая используется для
определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Реакцию
проводят в пробирках. В пробирке, где анатоксин и антитоксин находятся в
эквивалентном соотношении, наблюдается помутнение.
13.4. Реакция связывания комплемента
Антитела,
взаимодействуя с соответствующим антигеном, связывают добавленный
комплемент (1-я система). Индикатором связывания комплемента служат
эритроциты, сенсибилизированные гемолитической сывороткой, т.е.
антителами к эритроцитам (2-я система). Если комплемент не фиксируется в
1-й системе, т.е. не происходит реакция антиген-антитело, то
сенсибилизированные эритроциты полностью лизируются (отрицательная
реакция). При связывании комплемента иммунными комплексами 1-й системы
после добавления сенсибилизированных эритроцитов гемолиз от-
сутствует
(положительная реакция). Реакция связывания комплемента используется для
диагностики инфекционных болезней (гонореи, сифилиса, гриппа и др.).
13.5. Реакция нейтрализации
Микробы
и их токсины оказывают повреждающее действие на органы и ткани
организма человека. Антитела способны связываться с этими повреждающими
агентами и блокировать их, т.е. нейтрализовать. На этой особенности
антител основана диагностическая реакция нейтрализации. Ее проводят
путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные
тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). Например для обнаружения
токсинов в материале больного животным 1-й группы вводят материал
больного. Животным 2-й группы вводят аналогичный материал,
предварительно обработанный соответствующей антисывороткой. Животные 1-й
группы при наличии токсина в материале погибают. Вторая группа животных
выживает, повреждающее действие токсина не проявляется, так как
происходит его нейтрализация.
13.6. Реакции с использованием меченых антител или антигенов
13.6.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса)
Этот метод используется для экспресс-диагностики. С его помощью можно выявлять как микробные антигены, так и антитела.
Прямой метод РИФ —
иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами, причем антитела
метят флюорохромом — веществом, способным при попадании света
определенной длины волны испускать кванты света также определенной длины
волны. Особенность постановки этого метода заключается в необходимости
удаления непрореагировавших компонентов, чтобы исключить выявление
неспецифического свечения. Для этого проводят отмывание от
непрореагировавших антител. Результаты оценивают с помощью
люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой
люминесцирующей сывороткой, светятся на темном фоне по периферии клетки.
Непрямой метод РИФ используется чаще предыдущего. Эта реакция проводится в два этапа. На первом этапе антигены взаи-
модействуют
с соответствующими антителами, образуя иммунные комплексы. Все
компоненты, которые не прореагировали (т.е. не в составе иммунных
комплексов), должны быть удалены отмыванием. На втором этапе
образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью
флюорохромированной антиглобулиновой сыворотки. В результате образуется
комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антитела к
иммуноглобулинам кролика, меченные флюорохромом. Результаты оценивают с
помощью люминесцентного микроскопа.
13.6.2. Иммуноферментный метод или анализ
ИФА
— наиболее распространенный современный метод, используемый для
диагностики вирусных, бактериальных, протозойных инфекций, в частности
для диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов и др.
Модификаций
ИФА очень много. Широко используется твердофазный неконкурентный
вариант ИФА. Его проводят в 96-луночных полистироловых планшетах
(твердая фаза). При проведении реакции необходимо на каждом этапе
отмывать непрореагировавшие компоненты. При определении антител в лунки,
на которых сорбированы антигены, вносят исследуемую сыворотку крови,
затем антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. Проявляют реакцию,
добавляя субстрат для фермента. В присутствии фермента субстрат
изменяется, причем ферментсубстратный комплекс подбирают таким образом,
чтобы образующийся в реакции продукт был цветным. Таким образом, при
положительной реакции наблюдается изменение цвета раствора. Для
определения антигенов твердофазный носитель сенсибилизируется
антителами, затем последовательно вносятся исследуемый материал
(антигены) и сыворотка к антигенам, меченная ферментом. Для проявления
реакции вносят субстрат для фермента. Изменение цвета раствора
происходит при положительной реакции.
13.6.3. Иммуноблоттинг
Этот метод основан на сочетании электрофореза и ИФА. При проведении иммуноблоттинга (блоттинг от англ. blot — пятно) сложную смесь антигенов вначале подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Полученные фракционированные анти-
генные
пептиды переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Затем блоты
обрабатывают антителами к специфическому антигену, меченными ферментом,
т.е. проводят ИФА блота. Иммуноблоттинг используют в диагност?