Реакции иммунитета с меченными компонентами

В Основе реакций иммунитета лежит специфическое взаимодейс­твие между антигеном и антителами. Реакции происходят в том слу­чае, если антиген и антитела соответствуют, специфичны друг для друга. Следовательно, реакции иммунитета можно использовать в двух направлениях: 1)с помощью известных антигенов определить наличие антител в сыворотке крови больного и 2)с помощью извест­ных антител, которые содержатся в иммунной сыворотке, определить вид и тип микроорганизма.

Поскольку в реакциях иммунитета участвует сыворотка, их на­зывают серологическими (лат. serum — сыворотка).

Процесс взаимодействия антигена и антитела происходит в две фазы. Первая фаза — это специфическое соединение антигена и ан­тител, вторая — неспецифическая, видимая фаза, происходит обычно в присутствии электролитов. Видимое проявление зависит от анти­гена: если это корпускулярный антиген, например, микробы, то об­разуются хлопья (агглютинация), если антиген растворимый (моле­кулярно-дисперсный), например, белки или полисахариды, то обра­зуется осадок (преципитация).

Реакция нейтрализации токсина антитоксином

В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами — антитоксины. При их взаимодействии происходит нейтрализация ток­сина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитокси­ческой сыворотки. Внешнее проявление реакции — флоккуляция (по­мутнение).

Для обнаружения токсина с диагностической целью при боту­лизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксином в биологическом опыте на жи­вотных.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации — склеивание бактерий под влиянием

специфических антител. Реакция протекает в две фазы. В первой

фазе происходит специфическое присоединение антител к поверх­ности клетки, во второй — образование хлопьев в присутствии электролита (хлорида натрия). Видимая реакция происходит в том

случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому их них присоединяется антиген, и в результате образуется «решетка».

Методы постановки реакции агглютинации:

1)развернутая реакция агглютинации ставится в пробирках с последовательными разведениями сыворотки;

2)реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыво­ротки, разведенной 1:5 — 1:10; наступает в течение нескольких минут.

Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют а г г л ю т и н и р у ю щ у ю с ы в о р о т к у, полученную из крови животного (кролика, ба­рана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыворотки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию.

Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, образуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, нас­тупающая быстро — в течение двух часов.

Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает тонкозернис­тую агглютинацию в течение 18-24 часов.

Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации жи­вотных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специ­фичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом ад­сорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Полученные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела только к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С такими сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае не является ориентировочной.

Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в ка­честве известного антигена используют убитые культуры микробов, так называемые д и а г н о с т и к у м ы. При постановке се­рологического диагноза учитывают диагностический титр сыворотки

— для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютина­ции. Эту реакцию также используют в двух направлениях:

1)Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме­няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби­рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше­нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых плас­тин и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде «кру­жевного зонтика», при отрицательной реакции — плотный осадок эритроцитов в виде «пуговки».

2)Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс­ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос­тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от­ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест)

Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh+ эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антите­ла не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антите­лами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроци­тов.

Реакция преципитации

Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антиге­на под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитацион­ных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осторожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем ан­тигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципитата.

Реакцию применяют в судебной медицине для определения видо­вой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических исследованиях — для установления фальсификации пищевых продук­тов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммуниза­ции животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кро­лика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки — это наи­большее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыво­ротку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.

Реакция преципитации в геле агара проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.

Р е а к ц и я д в о й н о й и м м у н о д и ф ф у з и и ( п о О у х т е р л о н и ). Растопленный агаровый гель вы­ливают в чашку Петри и после затвердения в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие — иммунные сыворотки, ко­торые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.

Р е а к ц и я р а д и а л ь н о й и м м у н о д и ф —

ф у з и и ( п о М а н ч и н и ). В растопленный агаровый

гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застыва­ния агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, кото­рые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови им­муноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела про­тив них содержатся в специфических монорецепторных сыворотках.

Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направ­лению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антиге­ны и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образу-

ются линии преципитации.

Реакции иммунного лизиса

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфи­ческими антителами, образует иммунный комплекс, к которому при­соединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эрит­роциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериоли­за применяется для идентификации холерного вибриона.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Ге­молизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость — «лаковую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутс­твии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) — вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителооб­разующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в кото­рой предполагают наличие антител, и добавляют комплемент, инку­бируют в термостате 30 минут или 18-20 часов в холодильнике.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрица-

тельная (антител в исследуемой сыворотке нет), комплемент оста­нется свободным, и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонореи, сыпного тифа и других заболеваний.

РСК можно применять для определения антигена, например, ви­руса. В этом случае в качестве антител применяется диагностичес­кая иммунная сыворотка.

В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кро­ликов, иммунизированных эритроцитами барана.

Реакции с участием меченых антигенов или антител

Реакции основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сы­воротка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные со­единения (ИЭМ).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти­оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.

П р я м о й м е т о д Р И Ф. Из исследуемого материа-

ла, в котором предполагается наличие антигена (например, холер­ного вибриона), готовят препарат-мазок и обрабатывают его флюо­ресциирующей сывороткой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае — противохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдают светящиеся микробы.

Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь большой набор флюоресциирующих сывороток против каждого антиге­на.

Н е п р я м о й м е т о д Р И Ф. Препарат-мазок обра­батывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противо­холерной кроличьей сывороткой), а затем — флюоресциирующей ан­тиглобулиновой сывороткой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблюдают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.

При использовании этого метода можно иметь одну флюоресци-

рующую сыворотку против глобулинов кролика.

Иммуноферментный анализ. Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1)для определения неизвестного антигена с по­мощью известных антител или 2)для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реак­ции в том, что известный ингредиент реакции соединен с фермен­том, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) О б н а р у ж е н и е а н т и г е н а (Рис. 20). Пер­вый этап — адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлорид­ные поверхности лунок пластиковых панелей.

Второй этап — добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антитела­ми. После этого луночки промывают.

Третий этап — добавление специфической сыворотки, содержа­щей антитела против данного антигена, меченные ферментом. В ка­честве фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаля­ется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследу­емом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антиген-антитела, меченные ферментом. Для об­наружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстра­том служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно опреде­лить результаты опыта фотометрированием.

2) О б н а р у ж е н и е а н т и т е л (Рис. 21). Первый этап — адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обыч­но в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверх­ности твердой фазы — в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап — добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап — после отмывания лунок добавляют антиглобули­новые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положи-

тельные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются » б е з р е а г е н т н ы е » системы

для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверх­ностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести иссле­дуемый материал и наблюдать изменение окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг — это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделя­ют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита челове­ка. Затем переносят разделенные молекулы на поверхность нитро­целлюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Про­цесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток — блот (англ. blot — пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов челове­ка, меченную пероксидазой. После этого добавляют субстрат, кото­рый под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образу­ются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным ан­тигенам вируса.

Радиоиммуннологический анализ (РИА). Метод позволяет опре­делить не только наличие антигена в исследуемой пробе, но и его количество.

К иммунной сыворотке на первом этапе присоединяют исследуе­мый материал, предположительно содержащий антиген. На втором этапе добавляют известный антиген, меченный радиоизотопом, нап­ример, 125I. В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного (меченого) антигена с ограниченным ко­личеством антител. Так как меченый антиген добавляется в опреде­ленной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с неме­ченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счетчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Широкое внедрение РИА затруднено из-за необходимости соблю­дать правила работы с радиоактивным материалом.

Иммунноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяют специфическую антисыворотку, ме­ченную электронноплотным веществом. В качестве метки применяют

металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин), коллоидное золо­то. При непрямом методе к антигену присоединяют специфическую сыворотку, затем — антиглобулиновую меченую сыворотку.

При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы с присоединившимися к ним темными точ­ками — молекулами меченых антител (Рис. 22 и 23).

Медицинские биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных болезней

Диагностические препараты

Диагностические препараты предназначены для обнаружения

1)антигенов, 2)антител, 3)состояния повышенной чувствительности организма (Рис. 24).

Диагностические препараты, содержащие антитела, служат для определения антигена. Это агглютинирующие сыворотки (поливалент­ные, неадсорбированные, адсорбированные, монорецепторные), пре­ципитирующие сыворотки. Противовирусные сыворотки служат для вы­явления и определения вида и типа вирусов. Антитоксические сыво­ротки применяются в качестве диагностических для определения ви­да и типа экзотоксина. Флюоресцирующие сыворотки применяются в РИФ, антиглобулиновые сыворотки — для выявления глобулинов опре­деленного вида (человека, кролика). Сыворотки, меченные фермен­том, применяются в ИФА. Антительные эритроцитарные диагностикумы

— это антитела, адсорбированные на эритроцитах, применяются в РНГА — для обнаружения антигена, например, столбнячного или бо­тулинического экзотоксина. Моноклональные антитела — антитела наивысшей специфичности, полученные in vitro с помощью гибридом.

Диагностикумы, содержащие антиген, служат для выявления ан­тител в сыворотке крови больного. Взвесь убитых микробов — для реакции агглютинации. Высокоспецифические монодиагностикумы со­держат один антиген, например, О-антиген сальмонелл. Эритроци­тарный диагностикум — антиген, адсорбированный на эритроцитах — для РПГА. Вирусные антигены: гриппозный для определения антител к вирусу гриппа в РТГА; антигены ВИЧ — для ИФА.

Аллергены — препараты, полученные из микробов, служат для выявления повышенной чувствительности организма к возбудителю:

туберкулин, бруцеллин, тулярин, антраксин, орнитин, аллерген ге­молитического стрептококка и др.