Реакции иммунитета в микробиологии

Реакциями иммунитета (серологическими реакциями) называют действие между анти-генами и антителами, ведущее к образованию иммунного комплекса (антиген-антитело). Они протекают, как правило, в 2 фазы в присутствии дополнительного фактора (электролит, комплемент, фагоцит или др.). Специфическая фаза (невидимая, «химическая») происходит очень быстро и ха-рактеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела, В результате образуется комплекс, утрачивающий растворимость в изотонических растворах например, в растворе хлорида натрия. Неспецифическая фаза (видимая, «коллоидная») наступает через несколько минут или часов и характеризуется укрупнением комплекса антиген+антитело с изменением его физических свойств. Эта фаза сопровождается видимыми феноменами: выпадением осадка, образованием хлопьев, просветлением взвеси, остановкой движения частиц и др.

Реакции иммунитета высокоспецифичны и их широко применяют на практике для серодиагностики инфекций (по обнаружению антимикробных антител в сыворотке крови), определения вида и варианта микроба по антигенной структуре, определения других антигенов (аллергенов, гормонов, биологических образцов разного происхождения). Области применения реакций иммунитета: диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний, фармация, санитарно-ветеринарная служба, трансплантация органов и тканей (в т.ч. крови), судебная медицина.

Реакция агглютинации (РА) — это взаимодействие корпускулярного антигена (взвеси бактерий, других клеток или частиц) и антител — агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината (хлопьев из склеившихся частиц).

Реакцию ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предметном стекле и учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стекла. Более надежные результаты даёт использование адсорбированных и монорецепторных сывороток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развернутая (объёмная) РА более точна, она ставится в пробирках и учитывается через сутки. В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН — 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количество взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по ха-рактеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальнее разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикробных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при определении группы крови и т.п.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) является разновидностью непрямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинации, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген (или антитело) присоединяют к корпускулярному носителю — эритроцитам, убитым микробам или частицам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагносгикумы (антигенные или иммуноглобулиновые). РПГА с антигенным эритроцитарным диагностгкумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведениями сыворотки (например, с целью серодиагностики инфекций или выявления напряжённости иммунитета — по титру антител). При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроцитов на всей площади дна пробирки или лунки — «зонтик». При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре (в виде «пуговки»). РПГА с иммуноглобулиновыми диагности-кумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом мате-риале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.

Реакция преципитации (РП) — это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимодействии с сответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена, различные экстракты.

РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворотку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию (на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно оседает). Так определяют, например, антиген возбудителя сибирской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диаметром I мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 — в раствор антигена, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так оп-ределяют, например, С-реактивный белок (СРБ) при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, туберкулёзе, инфаркте миокарда (диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают путем иммунизации кроликов). Методы диффузной преципитации в агаровом геле: растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии антиген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар. В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.

В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фракционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в теле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой (антителами). В результате двойной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в разведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малыми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов (диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов) для выявления фальсификации пищевых продуктов (санитарная практика), для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей (судебно-медицинская практика).

Реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) — серологическая реакция между микробным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для определения титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой (в избытке), выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают (как и в контрольной группе животных, получивших тот же материал без сыворотки). В обычной лабораторной практике данную реакцию используют для диагностики ботулизма. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сывороткой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее определенное число минимальных летальных доз-DLM токсина (это количество соответствует I ан-титоксической единице, АЕ сыворотки). Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME (международных антитоксических единиц) в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерийной сыворотки нейтрализует 100 DLM дифтерийного токсина для морской свинки.

Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках — в реакции флоккуляции (разновидность РП). Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина (т.е. белкового антигена) с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение (инициальная флокку-ляция) наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина (анатоксина) и антитоксина (т.е. I TE (Lf) : I АЕ (МЕ)).

Реакция иммунофлюоресценции (ИФ) — взаимодействие люминесцирующих антител с корпускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на способности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами (ФИТЦ, акридиновым оранжевым и др.) без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию.

В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку (например, противочумные антитела, меченные ФИТЦ). После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высо-кочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики (ответ в течение 1-2 ч). Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материале, а также для их идентификации.

Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, которые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабатывают люминесцирующей: сывороткой с ослиными (лошадиными) AT к кроличьему белку (образуется двойной светящийся комплекс). Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Основан на использовании антител, меченных ферментом, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИФА широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале (сэндвич-метод) вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистироловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела (сыворотку), меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат (5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др.).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интенсивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител (например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции) на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом,и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учитывают так же. ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью.