Роль цитокинов в иммунитете
Иммунная система регулируется растворимыми медиаторами, которые называются цитокинами. Эти белки низкой молекулярной массы продуцируются фактически всеми клетками врожденной и адаптивной иммунной систем и в особенности CD4+-Т-клетками, которые регулируют многие эффекторные механизмы. Важным функциональным свойством цитокинов является регуляция развития и поведения клеток-эффекторов иммунной системы.
Некоторые цитокины непосредственно влияют на синтез и работу других цитокинов. Чтобы проще представить, как работают цитокины, сравним их с гормонами — химическими посредниками эндокринной системы. Цитокины служат химическими медиаторами в пределах иммунной системы, хотя также взаимодействуют с определенными клетками других систем, включая нервную. Таким образом, они участвуют в поддержании гомеостаза.
При этом они играют значительную роль в управлении гиперчувствительностью и воспалительным ответом и в некоторых случаях могут способствовать развитию острого или хронического повреждения тканей и органов.
Регулируемые определенным цитокином, должны экспрессировать рецептор к этому фактору. Позитивная и/или негативная регуляция клеточной активности зависит от количества и типа цитокинов, к которым чувствительна клетка, а также от повышения или снижения экспрессии цитокиновых рецепторов. В норме в регуляции врожденных и приобретенных иммунных ответов задействован комплекс этих методов.
История цитокинов
Активность цитокинов открыли в конце 1960 г. Первоначально предполагали, что они служат факторами амплификации, действующими антигензависимо, повышая пролиферативные ответы Т-клеток И.Джери (l.Gery) и соавторы впервые показали, что макрофаги высвобождали митогенный фактор тимоцитов, названный ими лимфоцитактивирующим фактором (LAF). Этот взгляд радикально изменился, когда обнаружили, что надосадочная жидкость мононуклеаров периферической крови, стимулированных митогеном, вызывает длительную пролиферацию Т-клеток в отсутствие антигенов и митогенов.
Вскоре после этого выяснилось, что для изоляции и клональной экспансии линий функциональных Т-клеток может использоваться фактор, продуцируемый самими Т-клетками. Этому фактору, полученному из Т-клеток, разные исследователи давали разные названия; наиболее известное среди них — Т-клеточный фактор роста (TCGF). Цитокины, продуцируемые лимфоцитами, назвали лимфокинами, а продуцируемые моноцитами и макрофагами — монокинами.
Результаты исследования клеточного источника лимфокинов и монокинов, в конечном счете, выявили, что эти факторы не были продуктами исключительно лимфоцитов или моноцитов/макрофагов, что осложнило понимание вопроса. Таким образом, как общее название этих гликопротеиновых медиаторов был принят термин «цитокин».
В связи с необходимостью выработки соглашения, регулирующего определение факторов, полученных из макрофагов и Т-клеток, в 1979 г. была создана международная рабочая группа, которая занималась разработкой их номенклатуры. Поскольку цитокины передавали сигнал от лейкоцита к лейкоциту, был предложен термин «интерлейкин» (IL). Макрофагальному фактору LAF и Т-клеточному фактору роста дали названия ин-терлейкин-1 (IL-1) и интерлейкин-2 (IL-2) соответственно. На сегодняшний день исследовано 29 интерлейкинов, и число их будет, несомненно, возрастать, поскольку продолжаются попытки идентифицировать новых представителей этого семейства цитокинов.
По мере приобретения новых знаний о функциональных свойствах цитокинов в термины, первоначально предназначенные для определения их функций, стали вкладывать более широкий смысл. Об этом свидетельствует и то, что терминология, принятая в 1979 г., устаревает. Хорошо известно, что многие интерлейкины оказывают важные биологические эффекты на клетки, не принадлежащие иммунной системе. Например, IL-2 не только активирует Т-клеточную пролиферацию, но и стимулирует остеобласты — клетки, формирующие кость.
Трансформирующий фактор роста β (TGFβ) также действует на клетки разных типов, в том числе фибробласты соединительной ткани, Т- и В-лимфоциты. Таким образом, цитокины в основном обладают плейотропными свойствами, поскольку они могут влиять на активность множества разных клеточных типов. Кроме того, среди цитокинов выражена избыточность функций, что доказывается, например, способностью активировать рост, выживаемость и дифференцировку В- и Т-клеток более чем одним цитокином (например, и IL-2, и IL-4 могут функционировать как Т-клеточные факторы роста). Этот избыток частично объясняется использованием общих сигнальных субъединиц цитокинового рецептора определенными группами цитокинов.
В конечном счете, цитокины редко, если вообще когда-нибудь, действуют в организме в одиночку. Таким образом, клетки-мишени восприимчивы к окружению, содержащему цитокины, которые часто проявляют аддитивные, синергитические или антагонистические свойства. В случае синергизма совместное действие двух цитокинов вызывает более выраженный эффект, чем сумма эффектов отдельных цитокинов. И наоборот, когда один цитокин ингибирует биологическую активность другого, говорят об их антагонизме.
С 1970 г. знания о цитокинах быстро увеличиваются благодаря их идентификации, определению функциональных характеристик и молекулярному клонированию. Удобная номенклатура, разработанная ранее на основании клеточных источников или функциональной активности определенных цитокинов, не была широко поддержана. Тем не менее время от времени по мере нахождения общих функциональных черт нескольких гликопротеинов вводятся дополнительные термины, определяющие это семейство цитокинов.
В частности, термин «хемокины», принятый в 1992 г., определяет семейство близкородственных хемотаксических цитокинов, имеющих консервативные последовательности и являющихся мощными аттрактантами для разных популяций лейкоцитов, таких как лимфоциты, нейтрофилы и моноциты. Для студентов-иммунологов изучение быстро расширяющегося списка цитокинов с разнообразными функциональными характеристиками может представлять значительные трудности. Однако достаточно сосредоточиться на отдельных заслуживающих особого внимания цитокинах, что будет интересной и посильной задачей.
Общие свойства цитокинов
Общие функциональные свойства
Цитокины обладают некоторыми общими функциональными чертами. Некоторые, такие как интерферон-у (IFNy) и IL-2, синтезируются клетками и быстро секретируются. Другие, такие как фактор некроза опухоли a (TNFα) и TNFβ, могут секретироваться или экспрессироваться как белки, связанные с мембранами. У большинства цитокинов очень короткий период полураспада; следовательно, синтез цитокинов и их функционирование обычно происходят импульсивно.
Рис. 11.1. Аутокринные, паракринные и эндокринные свойства цитокинов. Например, головной мозг отвечает на воздействие цитокинов как на эндокринное воздействие
Подобно полипептидным гормонам цитокины обеспечивают взаимосвязь между клетками в очень низких концентрациях (обычно от 10-10 до 10-15 М). Цитокины могут действовать локально и на ту клетку, которая их секретировала (аутокринно), и на другие близко расположенные клетки (паракринно); более того, они могут действовать системно, как гормоны (эндокринно) (рис. 11.1). Так же, как и другие полипептидные гормоны, цитокины проявляют свои функции, связываясь со специфичными рецепторами на клетках-мишенях. При этом клетки, регулируемые определенными цитокинами, должны экспрессировать рецептор для данного фактора.
Таким образом, активность отвечающих клеток может регулироваться количеством и типом цитокинов, к которым они чувствительны, или повышением/понижением экспрессии цитокиновых рецепторов, которые сами могут регулироваться другими цитокинами. Хорошим примером последнего положения служит способность IL-1 повышать экспрессию рецепторов для IL-2 на Т-клетках. Как отмечено ранее, это иллюстрирует одну общую черту цитокинов, а именно, их способность совместно действовать, создавая эффект синергизма, что усиливает их воздействие на единичную клетку.
При этом некоторые цитокины находятся в антагонистических отношениях с одним или более цитокином и таким образом ингибируют действие друг друга на данную клетку. Например, цитокины, секретируемые Т-хелперами (Тн1)-секретируют IFNy, который активирует макрофаги, ингибирует В-клетки и непосредственно токсичен для определенных клеток. Тн2-клетки секретируют IL- 4 и IL-5, которые активируют В-клетки и IL-10, который в свою очередь ингибирует активацию макрофагов (рис. 11.2).
Рис. 11.2. Цитокины, продуцируемые Тн1- иТн2-клетками
Когда клетки продуцируют цитокины или хемокины в ответ на различные стимулы (т.е. инфекционные агенты), те создают градиент концентрации, который позволяет контролировать или направлять клеточную миграцию, также называемую хемотаксисом (рис. 11.3). Клеточная миграция (т.е. хемотаксис нейтрофилов) необходима для развития воспалительных реакций, возникающих вследствие локального проникновения микроорганизмов или другой травмы.
Рис. 11.3. Стадии хемотаксиса нейтрофилов (обратимое связывание, последующая активация, адгезия) и трансэндотелиальная миграция (продвижение между эндотелиальными клетками, формирующими стенку кровеносного сосуда, экстравазация)
Хемокины играют ключевую роль в обеспечении сигналов, которые повышают экспрессию адгезионных молекул, экспрессируемых на эндотелиальных клетках для обеспечения хемотаксиса нейтрофилов и трансэндотелиальной миграции.
Общая системная активность
Цитокины могут действовать непосредственно в месте секреции и отдаленно, вплоть до системных эффектов. Таким образом, они играют решающую роль в усилении иммунного ответа, поскольку высвобождение цитокинов из всего лишь нескольких клеток, активированных антигеном, приводит к активации множества клеток различных типов, которые необязательно являются антигенспецифичными или находятся непосредственно в данной области. Особенно ярко это проявляется в реакциях ГЗТ, при которых активация редких антигенспецифичных Т-клеток сопровождается высвобождением цитокинов. Как следствие действия цитокинов в эту зону моноциты привлекаются в большом количестве, значительно превышающем изначально активированную Т-клеточную популяцию.
Также необходимо отметить, что продукция высоких концентраций цитокинов под влиянием мощных стимулов может запускать разрушительные системные эффекты, такие как синдром токсического шока, обсуждаемый далее в этой главе. Применение рекомбинантных цитокинов или антагонистов цитокинов, способных воздействовать на разные физиологические системы, обеспечивает возможность терапевтической коррекции иммунной системы, основанной на спектре биологической активности, которая связана с данным цитокином.
Общие клеточные источники и каскадность событий
Определенная клетка может продуцировать множество различных цитокинов. Более того, одна клетка может быть мишенью для многих цитокинов, каждый из которых связывается со своими специфичными рецепторами на клеточной поверхности. Следовательно, один цитокин может влиять на действие другого, что может привести к аддитивному, синергетическому или антагонистическому действию на клетку-мишень.
Взаимодействия множества цитокинов, выделяемых при типичном иммунном ответе, обычно называют цитокиновым каскадом. В основном именно этот каскад определяет, будет ли ответ на антиген преимущественно антитело-опосредованным (и если так, какие классы антител будут синтезироваться) или клеточноопосредованным (и если так, то какие клетки будут активироваться — обладающие цитотоксическим действием или участвующие в ГЗТ). Механизмы контроля, также опосредованные цитокинами, которые помогают определить набор цитокинов, выделяющихся после активации СD4+-Т-клеток.
Похоже, что в инициации цитокинового ответа этих клеток ведущую роль играет стимуляция антигеном. Таким образом, в зависимости от природы антигенного сигнала и набора цитокинов, связанных с активацией Т-клетки, наивная эффекторная СD4+-Т-клетка будет приобретать определенный цитокиновый профиль, который однозначно определит тип формируемого иммунного ответа (опосредованный антителами или клетками). Цитокиновый каскад, связанный с типами иммунного ответа, также определяет, какие еще системы активируются или угнетаются, а также выраженность и продолжительность иммунного ответа.
Общие рецепторные молекулы
Цитокины обычно обладают перекрывающимися, избыточными функциями: например, и IL-1, и IL-6 вызывают лихорадку и еще несколько общих биологических феноменов. Вместе с тем эти цитокины обладают и уникальными свойствами. Как будет обсуждаться далее, некоторые цитокины для распространения своего действия на клетки-мишени используют рецепторы, состоящие из нескольких полипептидных цепей, причем некоторые из этих рецепторов обладают по меньшей мере одной общей рецепторной молекулой, которую называют общей у-цепью (рис. 11.4). Общая у-цепь является внутриклеточной сигнальной молекулой. Эти данные помогают объяснить наличие перекрывающихся функций у разных цитокинов.
Рис. 11.4. Структурные характеристики членов семейства цитокиновых рецепторов I класса. Одинаковая у всех ү-цепь (зеленая) передает сигнал внутрь клетки
Р.Койко, Д.Саншайн, Э.Бенджамини
Опубликовал Константин Моканов
Цитокины— небольшие пептидные информационные молекулы. Они регулируют межклеточные и межсистемные взаимодействия, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность и апоптоз, а также обеспечивают согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия.
Цитокин выделяется на поверхность клетки А и взаимодействуют с рецептором находящейся рядом клетки В. Таким образом, от клетки А к клетке В передается сигнал, который запускает в клетке В дальнейшие реакции. Цитокины активны в очень малых концентрациях. Их биологический эффект на клетки реализуется через взаимодействие со специфическим рецептором, локализованным на клеточной цитоплазматической мембране. Образование и секреция цитокинов происходит кратковременно и строго регулируется.Все цитокины, а их в настоящее время известно более 30, по структурным особенностям и биологическому действию делятся на несколько самостоятельных групп. Группировка цитокинов по механизму действия позволяет разделить цитокины на следующие группы:
провоспалительные, обеспечивающие мобилизацию воспалительного ответа (интерлейкины 1,2,6,8, ФНОα, интерферон γ);
противовоспалительные, ограничивающие развитие воспаления (интерлейкины 4,10, TGFβ);
регуляторы клеточного и гуморального иммунитета — (естественного или специфического), обладающие собственными эффекторными функциями (противовирусными, цитотоксическими).
Спектры биологических активностей цитокинов в значительной степени перекрываются: один и тот же процесс может стимулироваться в клетке более чем одним цитокином. Во многих случаях в действиях цитокинов наблюдается синергизм. Цитокины — антигеннеспецифические факторы. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня цитокинов невозможна. Но определение их концентрации в крови даёт информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток; о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и о прогнозе заболевания.
Цитокины регулируют активность гормональной оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники:[1] например, интерлейкин-1, воздействуя на гипоталамус, усиливает синтез кортиколиберина, что, в свою очередь, повышает выработку АКТГ.
Методы иммунологической диагностики инфекционных болезней (собственно иммунный, серологический, аллергический), их цель, интерпретация полученных результатов.
Серологический метод. Серологические исследования основаны на физиологичеком феномене – образовании в организме, в сыворотке крови антител в ответ на попадание в организм чужеродного белка (антигена) – микроба, вируса, измененных тканей организма. Серологические исследования используются в практике при диагностике бактериальных, вирусных инфекциий, болезней, обусловленных нарушениями иммунной системы организма, в том числе инфекций, передаваемых половым путем.
Аллергический метод.Для подтверждения диагноза отдельных инфекционных болезней можно пользоваться и аллергическими кожными пробами. Для постановки кожной пробы в толщу кожи из шприца тонкой иглой вводят 0,1 мл диагностического препарата (например, при бруцеллезе — бруцеллина, который представляет фильтрат 3-недельной бульонной культуры бруцелл). При наличии заболевания бруцеллезом через 24 часа после постановки пробы Бюрне (см. 5) на месте введения бруцеллина образуется участок гиперемии, окруженный ин-фильтративным валиком (аллергическая реакция положительная). Такой же аллергический метод диагностики может применяться и при других заболеваниях, например при туляремии, с использованием для этой цели тулярина, который вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл; тулярин представляет взвесь убитых туляремийных бактерий с определенным содержанием микробных тел в 1 мл препарата.
Собственно иммунный метод.
1. Определение уровня C-реактивного белка. C-реактивный белок — белок острой фазы воспаления, относящийся к бета-глобулинам. C-реактивный белок, как и другие белки острой фазы воспаления, появляется в сыворотке вскоре после повреждения тканей и начала воспаления. Повышение уровня C-реактивного белка наблюдается при острых бактериальных и вирусных инфекциях, инфаркте миокарда, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях (см. гл. 15, п. II.Б).
2. Определение титра холодовых агглютининов. Холодовые агглютинины — это IgM, которые вызывают максимальную агглютинацию эритроцитов при 4°C. Холодовые агглютинины появляются при некоторых заболеваниях, например при микоплазменной пневмонии, реже при гриппе, аденовирусной инфекции и других острых респираторных заболеваниях, а также при сонной болезни. Диагностически значимым считается выявление холодовых агглютининов в титре 1:32 или четырехкратное повышение их титра в течение 7—14 сут.
3. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления (через 10—21 сут). Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.
4. Реакция Нейфельда — набухание клеточной стенки бактерий под действием антител к типоспецифическим капсульным полисахаридам, видимое при световой микроскопии. Эту реакцию можно наблюдать при добавлении антител, направленных против полисахаридов клеточной стенки Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis (серотипов A и C), к этим бактериям. Реакция Нейфельда применяется для исследования сыворотки и СМЖ.
5. Реакция с лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus) применяется для диагностики инфекций, прежде всего сепсиса и менингита, вызванных грамотрицательными бактериями. Метод основан на том, что при добавлении бактериальных эндотоксинов жидкий лизат амебоцитов меченосца превращается в гель.
23. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Реакция агглютинации, ее варианты, механизм. Нагрузочные реакции иммунитета (РНГА). Агглютинирующие сыворотки, диагностикумы, их действующее начало, механизм действия, область применения.
Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам. Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты. Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки.
1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам. Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию. Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C.
2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном. Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц. Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях.
АГГЛЮТИНИРУЮЩИЕ СЫВОРОТКИ, сыворотки различных животных, способные вызывать реакцию агглютинации.
24.Реакция преципитации, ее варианты, механизм, область применения. Преципитирующие сыворотки, их получение и титрование.
Реакция преципитации – это осаждение мелкодисперсного растворимого антигена под действием антител в присутствии электролита. Реакция очень
чувствительна в отношении антигена, она позволяет обнаруживать и идентифицировать буквально следы антигена. Варианты постановки: реакция кольцепреципитации, реакция преципитации в геле (агаре). Модификации РП: иммуноэлектрофорез, радиальная иммунодиффузия по Манчини,иммуноблотинг. Реакция преципитации применяется для индикации и идентификации антигена в исследуемом материале. РП получила распространение в судебно-медицинской экспертизе, используется для определения принадлежности пятен биологических жидкостей по видовой принадлежности белка. РП в агаре используется для определения токсигенности культур микроорганизмов (при диагностике дифтерии, стафилококкового токсикоза). Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини используется для определения разных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови. Иммуноэлектрофорез используется для определения белковых фракций сыворотки крови. Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов антигенами бактерий, их экстрактами и токсинами. Титром преципитирующей сыворотки называется то максимальное разведение антигена, при котором идет реакция преципитации. Преципитирующие сыворотки выпускаются с высоким титром — не менее 1:100000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет мелкодисперсную структуру и в единице объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме сыворотки — антител.
Специфические преципитирующие сыворотки применяются при диагностике инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляремия, дифтерия, и
др.), в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка, в санитарной практике для обнаружения соответствия белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию).
25. Реакция иммунного лизиса (бактериолиза, гемолиза). Компоненты реакциий, практическое применение.
Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят название лизинов. Эти АТ применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам — гемолизинами.
Лизины способны проявить свое лизирующее действие на АГ только в присутствии комплемента, который является составной частью любой свежей сыворотки.
Таким образом, в основе реакции лизиса лежит взаимодействие трех компонентов:
1) корпускулярного АГ (бактериальных клеток, эритроцитов и др. клеток);
2) специфических АТ иммунной сыворотки (бактериолизинов, гемолизинов и др.);
3) комплемента (сыворотка морской свинки).
В начале реакция идет по типу агглютинации, затем к комплексу АГ-АТ присоединяется комплемент. Наступает активация компонентов комплемента, которая приводит к лизису клеток (АГ).
В микробиологической диагностике реакция бактериолиза применяется для:
1) определения вида неизвестного микроба при помощи специфической сыворотки;
2) определения в исследуемой сыворотке наличия бактериолизинов к известному микробу.
Исследуемую сыворотку, для разрушения имеющегося в ней комплемента, инактивируют при 56 °С в течение 30 минут.
Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.
Реакция бактериолизина применяется при холере с целью идентификации вибрионов (р. иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса); при возвратном тифе с целью серодиагностики (р. лизиса).
Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с АТ-ми в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость — «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется как индикаторное при постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК), для титрования комплемента и гемолитической сыворотки.