Рпга для определения иммунитета
Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА/РНГА) основана на способности эритроцитов различных видов животных, птиц и человека (I(0) группы крови) адсорбировать на своей поверхности растворимые антигены бактерий или антитела.
Многие антигены бактерий способны спонтанно (антигены полисахаридной природы) или после предварительной обработки танином, бензидином или глюта-ровым альдегидом (антигены белковой природы) адсорбироваться на эритроцитах.
Такие комплексы называют эритроцитарными антигенными диагностикумами.
Иммуноглобулины также могут использоваться для сенсибилизации эритроцитов. В этом случае получают эритроцитарные антительные диагностикумы.
Участие эритроцитарных диагностикумов в специфических иммунных реакциях антиген—антитело обеспечивает пассивное скучивание и выпадение в осадок эритроцитов.
Реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) применяют с целью:
— обнаружения антител в сыворотке крови путем использования известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
— выявления неизвестного антигена на основе его взаимодействия с известным эритроцитарным антительным диагностикумом.
а) Методика РПГА для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Для постановки реакции необходимы:
— исследуемая инактивированная сыворотка больного (прогретая при 56 °С 30 мин);
— эритроцитарный антигенный диагностикум;
— гомологичная антигену контрольная иммунная сыворотка для РПГА в разведении 1:10;
— изотонический раствор натрия хлорида pH 7,0 ± 0,5;
— 40% раствор формалина;
— 10-50% взвесь несенсибилизированных эритроцитов барана;
— планшеты для иммунологических реакций с 96 круглодонными лунками;
— микропипетки.
Антигенные эритроцитарные диагностикумы представляют собой лиофилизированную в фосфатно-буферном растворе 1-10% взвесь эритроцитов барана, предварительно формалинизированных и сенсибилизированных антигеном микроорганизмов. Консервантом является формалин в конечной концентрации 0,5%. Диагностикумы выпускают в жидком или лиофильно-высушенном виде. В последнем случае они представляют собой аморфную массу, сформированную в таблетки красно-коричневого цвета. Регидратированный препарат готовят путем разведения этих таблеток в 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида и получают 1% рабочую взвесь. Диагностикумы выпускают в комплекте с гомологичной диагностической агглютинирующей сывороткой для РПГА в разведении 1:10 и 10-50% взвесью несенсибилизированных эритроцитов барана. Диагностическую сыворотку разводят в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и получают 10 мл сыворотки в разведении 1:100.
Взятую от больного на исследование сыворотку крови инактивируют прогреванием в инактиваторе (или на водяной бане) 30 мин при 56 °С. Готовят рабочее разведение сыворотки 1:100. Для этого вносят 0,1 мл цельной сыворотки в пробирку, содержащую 9,0 мл изотонического раствора натрия хлорида с 1 % формалина. Последний получают внесением 40% раствора формалина в 0,9% раствор натрия хлорида в соотношении 1:100. Тщательно перемешивают и используют в реакции.
Иногда в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам сыворотки предварительно обрабатывают 10-50% взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют через 1 ч инкубации при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.
Эритроцитарный диагностикум используют в рабочем разведении смешивая 1 мл диагностикума и 5 мл изотонического раствора с 1 % формалина.
1. Техника постановки. Реакцию ставят в планшетах для иммунологических исследований. В начале в лунки первого ряда планшета вносят по 0,05 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем в первую лунку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:100, перемешивают. Получают разведение сыворотки 1:200, из этой лунки переносят во вторую 0,05 мл сыворотки. Перемешивают, получают разведение 1:400. Затем 0,05 мл сыворотки из второй лунки переносят в третью. Получают разведение сыворотки 1:800 и т. д., проводя двукратные последовательные разведения сыворотки до уровня удвоенного диагностического титра. Из последней лунки диагностического ряда отбирают 0,05 мл с тем, чтобы объем жидкости был одинаков во всех лунках. После этого к разведенной сыворотке добавляют по 0,05 мл эритроцитарного антигенного диагностикума. Внесение равного объема диагностикума приводит к дополнительному двукратному разведению сыворотки в каждой лунке. Так, в первой лунке разведение становится 1:400, во второй — 1:800, в третьей-1:1600 и т.д.
Ставят 3 контроля:
— контрольная иммунная сыворотка в разведении от 1:100 в объеме 0,05 мл + 0,05 мл 1% взвеси диагностикума (положительный контроль);
— отрицательный контроль—взвесь диагностикума с нормальной сывороткой в таких же дозах;
— отрицательный контроль —0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50 + 0,05 мл 1% взвеси несенсибилизированных эритроцитов.
Планшет закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С 2 ч. Проводят предварительный учет результатов. Затем оставляют при комнатной температуре на 20-24 ч и делают окончательное заключение.
2. Учет результатов начинают с контролей. Затем оценивают диагностические реакции по четырехплюсовой системе:
++++ резко положительная реакция; эритроциты покрывают дно лунки в виде перевернутого зонтика с неровными краями;
+++ положительная реакция; эритроциты покрывают дно лунки в виде перевернутого зонтика, в центре которого просматривается небольшое кольцо из эритроцитов, не вступивших в реакцию;
++ положительная реакция; размер перевернутого зонтика небольшой, так как количество скученных эритроцитов невелико; остается значительное количество не склеившихся эритроцитов;
+ отрицательная реакция; эритроциты, не вступившие в агглютинацию, оседают на дно лунки в виде маленького диска (пуговки), вокруг которого незначительный ореол скученных эритроцитов; отрицательная реакция; осадок эритроцитов на дне в виде компактного диска (пуговки).
Титром антител считают разведение сыворотки, в котором РПГА положительна не менее, чем на ++ в самом большом разведении при полном отсутствии гемагглютинации в отрицательных контролях. Однако, так же как и при реакции агглютинации, необходимо проследить за его нарастанием через 10-14 дней.
б) Методика РПГА для обнаружения антигена. Для постановки реакции необходимы:
— исследуемый материал, содержащий антиген;
— эритроцитарный антительный диагностикум;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— нормальная сыворотка кролика;
— препараты для постановки контролей (см. ниже);
— планшеты для иммунологических реакций с 96 круглодонными лунками;
— микропипетки.
Диагностикум эритроцитарный антительный выпускают в виде сухой взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных иммуноглобулином сыворотки. Препарат ампулирован и имеет вид таблетки светло-коричневого цвета, легко растворимой в изотоническом растворе натрия хлорида.
Вместе со специфическим препаратом в коробке имеются контрольные препараты:
— ампула с формалинизированными танизированными, но не сенсибилизированными эритроцитами;
— 10-50% взвесь формалинизированных эритроцитов для адсорбции гетерогенных антител;
— взвесь стандартного антигена, гомологичного иммуноглобулинам сыворотки, использованной для сенсибилизации эритроцитов;
— иммунная сыворотка к искомому антигену.
1. Техника постановки. Предварительно из инактивированной нормальной сыворотки кролика в разведении 1:100 готовят раствор для разведения. Для этого в пробирку наливают 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида, к которому добавляют 0,1 мл сыворотки кролика. Этот раствор вносят микропипетками в дозе 0,05 мл в 7 лунок первого ряда планшета для иммунологических реакций. Затем в первую лунку добавляют 0,05 мл искомого антигена в разведении 1:5, получают разведение 1:10. Из этой лунки 0,05 мл переносят во вторую лунку, перемешивают, получают разведение 1:20 и так последовательно делают разведения антигена с шагом 2. Из последней лунки диагностического ряда выливают 0,05 мл раствора, чтобы объем антигена был одинаков во всех лунках. После этого в каждую лунку вносят по 0,05 мл эритроцитарного антителъного диагностикума в концентрации, указанной в наставлении к препарату. Это приводит к дополнительному разведению антигена, и в первой лунке конечное разведение антигена составит 1:20, во второй — 1:40, в третьей— 1:80 и т.д.
Контроли:
— положительный контроль — стандартный известный антиген в рабочем разведении + эритроцитарный антительный диагностикум;
— отрицательный контроль — аналогичный исследуемому материалу субстрат, но заведомо не содержащий антигена + эритроцитарный антительный диагностикум;
— отрицательный контроль — исследуемый материал + десенсибилизированные эритроциты для исключения неспецифического склеивания эритроцитов. При исследовании крови этот контроль может оказаться положительным. В этом случае перед постановкой реакции проводят сорбцию исследуемого образца десенсибилизированными эритроцитами.
2. Учет результатов проводят так же, как и в предыдущем методе. Титром антигена считают дозу, с которой эритроцитарный антительный диагностикум реагирует в реакции гемагглютинации на ++ в самом большом разведении при полном отсутствии гемагглютинации в отрицательном контроле.
в) РПГА для определения классов иммуноглобулинов. РПГА может применяться не только для обнаружения и установления титра антител в сыворотке крови, но и для определения их принадлежности к определенному классу иммуноглобулинов (IgM или IgG). Это бывает важно для выявления внутриутробного инфицирования, установления периода развития или рецидива болезни. Дифференцировка макро (IgM)- и микро (IgG) — глобулинов основана на различиях их свойств. Одним из методов является инактивация крупномолекулярных IgM редуцирующими веществами (цистеином или 2-меркаптоэтанолом). При этом происходит разрыв их дисульфидных связей с образованием неактивных субъединиц. Молекулы же IgG не меняют свою структуру и сохраняют антительную активность. Методика с использванием цистеина для этих целей (по Е. В. Чернохвостовой, 1965) описана ниже.
1. Техника постановки. Навеску цистеина 314 мг растворяют в 10 мл 0,2 М раствора натрия гидроксида. Исследуемую сыворотку разводят ФСБ pH 7,2 в соотношении 1:5 и делят на 2 части, разливая в пробирки. В одну из них добавляют равный объем приготовленного раствора цистеина, в другую—равный объем изотонического раствора натрия хлорида. Пробирки со смесями закрывают резиновыми пробками и выдерживают 18-20 ч в термостате при 37 °С.
После инкубации сыворотки разводят двукратно и используют в РПГА. В одном ряду лунок ставят реакцию с сывороткой, не обработанной цистеином, в другом — с сывороткой, обработанной цистеином.
2. Учет результатов проводят как обычно по 4-плюсовой системе в обоих рядах лунок.
Если титры антител в обоих рядах совпадают, это свидетельствует о том, что антитела сыворотки относятся к классу IgG. Если же они в ряду, где использовалась сыворотка, обработанная цистеином, ниже в 4 раза и более, чем в ряду, где сыворотка не обрабатывалась цистеином, антитела относятся к классу IgM.
Для определения классов антител аналогичным способом может быть использована и РСК.
— Читать далее «Методика проведения реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА)»
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019
Под РПГА понимают реакцию, в которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях — эритроцитах, которые при этом склеиваются (рис.29).
Компоненты РПГА, применяемой для определения напряженности поствакцинального противодифтерийного антитоксического иммунитета:
1) испытуемая сыворотка крови в разведениях от 1:10 до 1:20480;
2) диагностикум дифтерийный эритроцитарный – дифтерийный анатоксин, адсорбированный на поверхности эритроцитов;
3) физиологический раствор;
4) противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью 10МЕ/мл;
5) полистероловые пластины (при их отсутствии – пробирки).
Испытуемую сыворотку разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках.
Вносят по 1 капле диагностикума в каждую лунку.
Ставят контроли специфичности реакции с иммунной противодифтерийной антисывороткой (положительная реакция) и нормальной сывороткой (отрицательная реакция).
Противодифтерийную контрольную сыворотку (с активностью 10МЕ/мл) разводят от 1:10 до 1:20480 и вносят также по 1 капле диагностикума.
Оставляют при комнатной температуре на 3 часа (максимум на 15-20 часов) и читают реакцию.
При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями. При отрицательной реакции эритроциты выпадают в осадок в виде меленького диска с ровными краями («пуговки»).
Титром антитоксина в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов.
Расчет активности испытуемой сыворотки производят по формуле:
Х=(10ЧА)/В,
где: Х – активность испытуемой сыворотки в МЕ/мл.;
10 – титр контрольной сыворотки в МЕ/мл.;
А – максимальное разведение испытуемой сыворотки с положительным результатом;
В – максимальное разведение контрольной сыворотки с положительным результатом.
Неиммунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мл. (1:20).
РПГА с целью определения напряженности противоскарлатинозного антитоксического иммунитетаставятсанатоксином S. pyogenes, адсорбированным на поверхности эритроцитов.
Реакция преципитации (РП): термопреципитации по Асколи и РП в геле по Оухтерлони
Преципитация и агглютинация – это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ. В первом случае он представлен в растворимой, во втором – в корпускулрной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ-АТ.
РП высоко специфична и чувствительна.
Ингредиенты реакции:
1) растворимый АГ или гаптен (преципититоген);
2) АТ-преципитины (иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими АГ);
3) изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.
Методы постановки РП:
1. РП в растворах – реакция кольцепреципитации;
2. РП в геле.
Постановка РП по Асколи с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл.
Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген — гаптен B.anthracis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
В качестве сибиреязвенного термопреципитиногена используют прокипяченые и профильтрованные водные экстракты органов и тканей трупного материала.
Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки. Затем по стенке пробирки осторожно наслаивают преципитиноген. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации (рис.30).
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ. раствор;
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
РП в геле по Оухтерлони (реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов (бляшек), перпендикулярных к полоске бумаги. В качестве положительного контроля берут заведомо токсигенную культуру. Инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации (рис.31).
Корь относится к управляемым инфекциям. Заболевают корью чаще непривитые дети дошкольного возраста и лица, не имеющие достоверных сведений о прививках. Эта группа лиц остается высоко восприимчивой к кори в течение всей жизни.
Начиная с 1967 года, в СССР была введена обязательная вакцинация живой коревой вакциной. Это привело к формированию высоких показателей иммунной защиты среди населения (около 90 – 93 %) и, как следствие, к резкому снижению заболеваемости корью. В настоящее время корь регистрируются редко (спорадические случаи). В основном это заносы инфекции из менее благополучных районов, где охват прививками еще недостаточен. Многолетняя иммунизация живой коревой вакциной позволила утвердить в 2002 г. программу по ликвидации кори на территории Российской Федерации (приказ МЗ от 19 августа 2002 г. №270 «Об утверждении программы ликвидации кори на территории Российской Федерации к 2010 г.»). Однако корь все еще распространена в некоторых соседних развивающихся странах и в странах со слабой инфраструктурой здравоохранения. В этих условиях особую значимость приобретает постоянный контроль за состоянием специфического иммунитета у разных возрастных групп населения. Кроме того обязательно лабораторное подтверждение всех случаев кори и заболеваний, подозрительных на корь.
Стойкий, практически пожизненный иммунитет к коревой инфекции формируется у людей, переболевших корью, и в результате вакцинации живой коревой вакциной (все дети должны быть привиты против кори дважды: в 1 год и в 6 лет). У вакцинированных невосприимчивость к кори может сохраняться годами. Серологические реакции, используемые для выявления коревых антител, высокоспецифичны. Это обусловлено тем, что у вируса кори единый антигенный вариант.
Антитела к вирусу кори могут быть выявлены при использовании различных серологических реакций: реакции нейтрализации (РН), реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментного анализа (ИФА) и ряда других. «Золотым стандартом» при оценке титра коревых антител является РТГА. Существует четкая корреляция между присутствием в крови людей противокоревых антител, выявляемых в РТГА, и невосприимчивостью к кори. Однако применение РТГА затруднено из-за необходимости использования в качестве компонента эритроцитов обезьян, что, как правило, недоступно.
В Отделе Новых Технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера выпускается коревой эритроцитарный диагностикум (КЭД) для РПГА (Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/06289 от 15.08.2011 г.). Параметры РПГА с диагностикумом отрабатывались таким образом, чтобы она соответствовала чувствительности РТГА.
Специфический компонент диагностикума представляет собой эритроциты барана, стабилизированные акриловым альдегидом, с адсорбированным на них коревым гемагглютинирующим антигеном. Исследования показали, что присутствие у обследуемых лиц даже незначительной концентрации коревых антител (в разведении сыворотки 1:10), выявляемых в РПГА, защищает от заболевания. Это подтверждено ранее при изучении большого количества очагов в период значительного распространения кори (1973 — 1981 гг.).
Коревой эритроцитарный диагностикум (КЭД) для РПГА используется для оценки противокоревого иммунитета и для ретроспективной диагностики кори.
Оценка противокоревого иммунитета с помощью коревого эритроцитарного диагностикума в РПГА в разных возрастных группах свидетельствует о том, что у 93 – 95 % привитых и ревакцинированных выявляются специфические антитела, что говорит о высокой иммунной прослойки к кори у населения.
При ретроспективной диагностике кори исследованию подлежат парные сыворотки обследуемых. Специфика кори такова, что коревые антитела обнаруживаются в первые дни заболевания в момент появления высыпаний на коже. Поэтому первую сыворотку необходимо получать не позднее 1 − 3 дней с момента появления сыпи, а вторую — через 12 — 14 дней. При исследовании парных сывороток реакцию ставят параллельно в двух рядах планшета. Диагноз кори считается подтвержденным у лиц, в сыворотках крови которых регистрируется четырехкратное и более нарастание титра антител.
Коревой эритроцитарный диагностикум обеспечивает высокую чувствительность и специфичность анализа, прост в постановке и удобен в использовании.
Все материалы