Серодиагностика отличие истинной от анамнестической реакции иммунитета
• распознавание лимфоцитами антигена в нативном состоянии (например, молекулы патогена) и представленного на поверхности модифицированных клеток (например, заражённых вирусами);
• деструкция патогена и повреждённых клеток;
• элиминация (выведение) продуктов деструкции из организма;
• формирование иммунной памяти.
В иммунном ответе выделяют индуктивную и эффекторную (продуктивную) фазы. В индуктивную фазу происходит презентация антигена, т.е. передача информации об антигене от клеток врождённого иммунитета (АПК) инициаторам адаптивного иммунитета — Т-хелперам.
Затем выбирается путь дальнейшего развития иммунного ответа по клеточному или гуморальному пути: через индукцию дифференцировки разновидностей Т-хелперов (Th1, Th2, Th17 и других).
Наконец, при участии этих Т-хелперов происходит параллельная дифференцировка эффекторных клеток и клеток памяти. Эффекторная фаза иммунного ответа состоит в выполнении своих функций образовавшимися эффекторными клетками. Эта активность реализуется в форме клеточной или гуморальной иммунной защиты. В конце иммунного ответа благодаря включению регуляторных механизмов прогрессирование иммунных реакций замедляется и в результате приводит к их прекращению. Дифференцировавшиеся в процессе иммунного ответа клетки памяти активируются только при повторной встрече с антигеном — при вторичном иммунном ответе. Он протекает в принципе так же, как первичный, но развивается быстрее и реализуется значительно эффективнее первичного.
Этапы иммунного ответа (ИО). Начальный во входных воротах инфекции. Особенности местного иммунитета: неспецифические и специфические защитные механизмы кожных покровов и слизистых оболочек.
• Началом процесса служит проникновение Аг во внутреннюю среду организма. В природе это происходит при травмировании покровных тканей. При этом в них выделяются определённые вещества (стресc-протеины, белки теплового шока, цитокины кератиноцитов и клеток соединительной ткани) — медиаторы доиммунного воспаления, которые и «готовят почву» для развития лимфоцитарного иммунного воспаления (если это потребуется).
• Доиммунные защитные реакции в отношении Аг направлены на то, чтобы не пустить Аг глубже покровов. В первую очередь это сосудистые реакции: расширение сосудов микроциркуляторного русла, повышенный выпот из сосудов в ткани плазмы или сыворотки (соответственно всех сывороточных факторов доиммунной резистентности к инфекциям) и экстравазация лейкоцитов (в первую очередь — фагоцитов-нейтрофилов. Локальный отёк препятствует всасыванию Аг в системную циркуляцию.
♦ Проникший в покровы патоген сорбируют и поглощают эндоцитозом ДК, фагоцитируют макрофаги. И те, и другие — профессиональные АПК, но только ДК обладают особыми способностями — мигрируют из покровов (вместе с Аг) в региональные лимфоидные органы.
♦ Кроме АПК, в покровных тканях Аг встречают внутриэпителиальные лимфоциты.
♦ Не «перехваченный» в барьерных тканях и всосавшийся в системную циркуляцию Аг, если он опасен для организма, сразу начнёт приносить вред. Тем не менее иммунный ответ на него ещё может развиться, поскольку АПК (ДК и макрофаги) присутствуют и в синусоидах селезёнки, через которую за цикл циркуляции проходит весь объём крови.
Промежуточный этап иммунного ответа -распознование антигена, активация, пролиферация и дифференцировка ИКК. Межклеточная кооперация в иммунном ответе. Основные стадии иммунного ответа на тимусзависимые (эндоцитоз, процессинг, экспрессия антигенов, презентация) и тимуснезависимые антигены.
• В T-зависимых зонах лимфатических узлов ДК представляют Аг (в комплексе с MHC-II) для «рассмотрения» интенсивно мигрирующим T-лимфоцитам.
♦ Двойное распознавание —процесс распознавания Т-хелпером фрагментов пептидного Аг, в комплексе с МНС-I/II.
• Распознавший Аг T-лимфоцит начинает пролиферировать и дифференцироваться. В результате образуется клон антигенспецифичных дифференцированных T-лимфоцитов. Такие T-лимфоциты называют иммунными лимфоцитами, лимфоцитами-эффекторами. В процессе дифференцировки T-лимфоцит экспрессирует в надлежащем количестве мембранные молекулы и секретирует цитокины, необходимые для взаимодействия с B-лимфоцитами, лейкоцитами или для атаки на клетки-мишени.
• В T-зависимых зонах периферических лимфоидных органов происходит взаимодействие активированных Аг T-лимфоцитов с активированными Аг B-лимфоцитами.
• Провзаимодействовавший с Аг и с T-лимфоцитами B-лимфоцит мигрирует в зону фолликула, где пролиферирует и дифференцируется в антителопродуцента — плазматическую клетку.
• Иммунные Т-лимфоциты (ЦТЛ, Th1, Th2) выходят из региональных лимфатических узлов через эфферентные лимфатические сосуды, попадают в системную циркуляцию, а оттуда — в очаг воспаления в месте проникновения или диссеминации патогена.
• Если T-лимфоцит в очаге воспаления находит и связывает свой Аг, то он начинает усиленно синтезировать и секретировать эффекторные молекулы — цитотоксины, непосредственно обеспечивающие убийство клеток-мишеней, или цитокины, «нанимающие» для деструкции Аг те или иные лейкоциты (макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы, нейтрофилы).
33. Конечный этап иммунного ответа –освобождение организма от патогена, супрессия ИО и формировапние иммунологической памяти и протективного иммунитета (постинфекционного, инфекционного, с преобладанием гуморального (антибактериального, антитоксического и др.) или клеточного иммунитетов), слабонапряженного, типоспецифического и др. Примеры.
• В эффекторной фазе иммунного ответа связанный Аг подвергается фагоцитозу и разрушению гидролитическими ферментами, кислородными радикалами, радикалами оксида азота до мелких метаболитов, которые экскретируются из организма через системы выделения (почки, ЖКТ).
• Второй результат лимфоцитарной иммунной реакции — иммунологическая память.
Иммунологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Принципы использования реакций иммунитета в диагностике инфекционных заболеваний. Компоненты и механизм иммунологических реакций. Экспресс диагностика.
Цель: поиск антигенов микробов в патологическом материале с помощью серологических иммунных реакций.
Серологическими называют реакции иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (AT). Детерминанта АГ связывается с активным центром AT. Серологические реакции протекают в две фазы. Первая — специфическая невидимая — заключается во взаимодействии АГ с AT. Вторая фаза — видимая — проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, AT и другими ингредиентами реакций. Различают несколько типов реакций: агглютинация, преципитация (иммунная диффузия), лизис, нейтрализация и др.
35. Серодиагностика инфекционных заболеваний. Динамика образования антител, первичный и вторичный иммунный ответ. Отличие истинной от анамнестической реакции иммунитета. Диагностическая ценность определения нарастания титра антител и отдельных классов иммуноглобулинов.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке больного. Для его реализации используют различные реакции иммунитета, как простые (агглютинация и ее разновидности), так и сложные (РСК, ИФА и др.).
Классическая серодиагностика основана на:
1). Определении антител к возбудителю в диагностическом титре;
2). Обнаружение в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета. 3). При экзотических инфекционных болезнях, а также при гепатитах, ВИЧ- инфекции и при некоторых других заболеваниях сам факт определения антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение.
Серологический метод диагностики применяют с конца первой-начала второй недели заболевания.
Для обнаружения антитела к исследуемой сыворотке прибавляют известный антиген. Эти препараты, называемые диагностикумами, представлят собой взвесь убитых микроорганизмов (их отдельных антигенов) или эритроцитов (частиц латекса), на которых адсорбированы микроорганизмы или их антигены.
Аллергический метод диагностики инфекционных заболеваний. Фазы, механизм, защитная и патогенетическая роль инфекционной аллергии(ГЧЗТ). Диагностические препараты для постановки кожно-аллергических проб (корпускулярные и растворимые).
При многих инфекционных заболеваниях развивается состояние повышенной чувствительности к повторному введению возбудителя или продуктов его жизнедеятельности. Такое состояние, называемое инфекционной аллергией,характерно для туберкулеза, туляремии, бруцеллеза, сапа, сифилиса, сибирской язвы, токсоплазмоза, паротита, простого герпеса и ряда других инфекций.
Для выявления инфекционной аллергии применяют аллергические диагностические пробы, для чего строго внутрикожно вводят соответствующий аллерген. Наличие гиперемии и инфильтрата указывает на положительный результат реакции, т. е. на наличие инфекционной аллергии.
Аллергический метод диагностики основан на аллергической реакции – реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).
* Введение внутрикожно Агбактерий
* Через 48 – 72 часа появляется воспаление
* Измеряют величину покраснения и папулы
В реакциях ГЗТ участвуют: Т-хелперы (стимулируют образование Т-эффекторов через ИЛ-2) → Т-эффекторы (продуцируют лимфокины — хемоаттрактанты и привлекают макрофаги в очаг воспаления) → макрофаги (продуцируют медиаторы-монокины) →мононуклеарный инфильтрат на месте введения аллергена → величина инфильтрата зависит от степени сенсибилизации организма и достигает максимума через 24-48 ч.
Аллергические диагностические пробы позволяют диагностировать туберкулез (реакция Манту), бруцеллез (проба Бюрне), туляремию (проба с тулярином), сибирскую язву (проба с антраксином), мягкий шанкр (реакция Дюкрея), проказу (реакция Мицуды), а последняя — даже дифференцировать туберкулоидную (лепромин-положительную) форму от лепроматозной (лепромин-отрицательной).
Положительная кожная аллергическая проба указывает, что введение аллергена при постановке пробы является повторным, т. е. индивидуум в прошлом имел контакт с микробным агентом. Здесь сказывается основной недостаток диагностической ценности кожно-аллергических проб, так как они могут быть положительными не только у инфицированных, но и у привитых против этих болезней, а также у лиц, переболевших много лет назад, в том числе и у носителей, т. е. положительный тест у здоровых лиц указывает только на контакт с микробным антигеном.
Особенности антибактериального иммунитета: неспецифические и специфические факторы. Иммунитет против внутриклеточных паразитов (иммунитет при туберкулезе, лепре, бруцеллезе, сифилисе и др.).Защитная роль антител. Антитоксический иммунитет. Механизмы нейтрализации экзотоксинов.
Антитоксический – гуморальный:
- Нейтрализация токсической группы
- Изменение рецепторов экзотоксина
- Преципитация АГ+АТ – фагоцитоз
Противобактериальный
1. Внеклеточные МО — ГИО:
- 1. Иммунный лизис: антитело присоединяется к бактерии, этот комплекс активирует комплемент = лизис бактерии
- 2. Иммунный фагоцитоз: антитело участвует в опсонизации и повышает способность фагоцитов захватывать и переваривать микробы.
- 3. Блокада инвазии: Блокада прилипания бактерии к рецепторам эпителиальных клеток. Осуществляется секреторным IgA при участии ИФ.
- 4. Нейтрализация антифагоцитарных факторов (капсулы)
2. Внутриклеточные МО – КИО. Элиминация бактерий — путем образования инфекционной гранулемы (т.е. в основном по Т-эффекторному типу).
Противогрибкового
1. Основной механизм – ГИО, включающий элементы: гриб + АТ + комплемент = лизис.
Неспецифические факторы защиты: альтернативный путь активации системы комплемента, фагоциты, ЕК.
2. КИО идет по Т-хелперному и Т-эффекторному путям.
а) Т-хелперы + гамма-интерферон = фагоцитоз;
б) Т-эффекторы = инфекционная гранулема.
При микозах резко повышается содержание IgЕ — способствует развитию аллергии и стимулирует быстрое воспаление. От частой стимуляции Т-супрессоров может возникать анергия.
В связи с высокой специфичностью и чувствительностью реакции взаимодействия антигена и соответствующего ему антитела эти реакции широко применяются для лабораторной диагностики инфекционных болезней.
Серологические реакции применяют в двух направлениях:
1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью известного антигена (серологический метод диагностики инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма при его идентификации с помощью известного антитела.
В зависимости от свойств антигена и особенностей среды, в которой взаимодействуют антигены и антитела, различают реакцию агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, нейтрализации и др.
Реакции агглютинации (РА) — склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток под действием антител в присутствии солей (обычно используется изотонический раствор хлорида натрия). Определяемые антитела (агглютинины) находятся либо в сыворотке крови больного человека либо иммунного животного; антигеном является взвесь убитых или живых микроорганизмов.
Для получения сыворотки кровь у человека берут обычно из вены, собирают в стерильную пробирку, оставляют на час при комнатной температуре или при 370 С на 30 мин. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой, пробирку оставляют в холодильнике на ночь для лучшего отделения сыворотки. На следующий день сыворотку отсасывают, при необходимости освобождают от форменных элементов крови центрифугированием.
Иммунные диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенному антигену, получают чаще из крови кроликов или лошадей, многократно иммунизированных соответствующим антигеном (взвесь живых или убитых микроорганизмов, анатоксины, экстракты клеток и тканей, эритроциты и т. п.). Нередко такие сыворотки, содержат групповые антитела, агглютинируя родственные между собой микробные виды, содержащие общий групповой антиген. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба. Устраняют групповую агглютинацию путем смешивания сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что приводит к адсорбции на их поверхности соответствующих антител (метод Кастеллани). В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба или его антигена. Полученная сыворотка является строго специфичной и называется адсорбированной (типовой, монорецепторной).
Для определения антител в крови больного человека можно использовать живые культуры микроорганизмов, однако чаще используются взвеси убитых микроорганизмов (диагностикумы). Реакция агглютинации ставится в 2 вариантах: ориентировочная реакции на стекле и развернутая реакция в пробирках.
Для постановки ориентировочной реакции агглютинации на предметное стекло наносят по 2 капли известной сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора вносят петлей культуру исследуемого микроорганизма, тщательно перемешивают и через 1-3 минуты учитывают реакцию. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контрольной. Реакция считается положительной в том случае, когда в капле, где культура смешана с сывороткой, выпадают хлопья агглютината, контроль сыворотки остается прозрачным, а в контроле антигена отмечается равномерное помутнение (рис.35, см. приложение).
Постановка развернутой реакции агглютинации предполагает приготовление разведений (обычно двукратных в объеме 1,0 мл) известной диагностической или исследуемой от больного человека сыворотки, в которые добавляют 0,1 мл (2 капли) живых или убитых микроорганизмов. В качестве двух контролей используют сыворотку в максимальной концентрации (антиген в нее не вносят), а также изотонический раствор хлорида натрия, в который вносят антиген. Положительная реакция характеризуется выпадением на дно пробирок хлопьевидного или зернистого осадка в виде зонтика, жидкость над осадком при этом просветляется. При встряхивании осадка (агглютината) видны хлопья, плавающие в прозрачной жидкости. В контроле антигена наблюдается осадок в виде пуговки (при встряхивании — равномерное помутнение), в контроле сыворотки – полная прозрачность (рис. 12).
| Рис. 12. Развернутая реакция агглютинации |
В практической работе нередко ставят РА по типу Видаля, основывающейся на обнаружении агглютининов (антител) в сыворотке крови больных. Эта реакция используется с целью подтверждения инфекционной болезни, вызванной тем или иным возбудителем: для диагностики брюшного тифа (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция с риккетсиями Провачека), бруцеллеза (реакция Райта и Хеддельсона), туляремии и других заболеваний. Реакцию проводят на второй неделе заболевания, когда в крови накапливается достаточно высокий титр антител к возбудителю.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)—агглютинация эритроцитов, нагруженных антигеном или антителом, под влиянием специфических антител или антигенов с целью определения неизвестных антител или антигенов (рис. 13, рис. 34, см. приложение). Реакцию ставят в специальных полистироловых планшетах (обычно в двукратных разведениях сыворотки или материала, содержащего антиген, объемом 0,2 мл), добавляют соответствующий антигенный или антительный эритроцитарный диагностикум, выдерживают в термостате при 370 С или при комнатной температуре 2 часа, учет производят сразу после этого или на следующий день. Контролем служит взвесь эритроцитов с заведомо иммунной и нормальной сыворотками. В первом случае должна произойти агглютинация, во втором ее не должно быть. Контролем антигена служит взвесь нормальных эритроцитов, к которым добавлена испытуемая сыворотка, а также раствор хлорида натрия, к которому добавляют эритроцитарный диагностикум (в обоих контролях не должно быть агглютинации).
| Рис. 13. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации — РНГА |
Реакция латекс-агглютинации – агглютинация частиц полистирольного латекса, нагруженных антигенами или антителами, в присутствии соответственно антител или антигенов.
Реакция угольной агломерации (РУА) выполняется аналогично реакции латекс-агглютинации, однако вместо частиц полистирольного латекса используют мелкодисперный уголь с адсорбированными на нем специфическими моноклональными антителами.
Реакция коагглютинации основана на способности белка А золотистого стафилококка вступать в реакцию с Fc-фрагментом иммуноглобулина G. Fab фрагменты IgG, обладающие функцией антител за счет активных центров, вступают в специфическую реакцию с гомологичным антигеном, вызывая агглютинацию стафилококка.
Опсонофагоцитарная проба. Опсонины представляют собой сывороточные белки (антитела, компоненты комплемента и др.), усиливающие фагоцитоз. Опсоно-фагоцитарную ставят при бруцеллезе, сыпном тифе и других болезнях. Учитывают реакцию по данным определения фагоцитарного показателя (среднее количество микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом при подсчете в мазке не менее 100 фагоцитов), опсонического индекса (ОИ — отношение фагоцитарного показателя иммунной сыворотки к фагоцитарному показателю нормальной сыворотки), опсоно-фагоцитарного индекса (ОФИ) и титра опсонинов (ТО).
Для определения ОИ исследуемый и контрольный образцы крови инкубируют 15 мин в смеси со стандартным количеством тест частиц (микроорганизмы, грибы, латекс). Из каждой пробы готовят мазки, фиксируют их жидким фиксатором, окрашивают метиленовой синькой или по Романовскому-Гимза. Подсчитывают число фагоцитарных частиц в 100 фагоцитах, находят фагоцитарные числа обеих проб и устанавливают ОИ.
ОФИ, в отличие от ОИ, отражает состояние и изменение опсонических свойств, вызванные антителами и комплементом, и фагоцитарной активности лейкоцитов больного к специфическому возбудителю. Методика постановки и учета ОФИ при разных заболеваниях различна (визуальная, культуральная, изотопная). При визуальном варианте в пробирку с 0,25 мл 2% раствора цитрата натрия добавляют 0,5 мл крови больного и 0,25 мл гретой суточной агаровой культуры возбудителя заболевания плотностью 1 млрд/мл (по кишечному стандарту). Смесь инкубируют 30 мин при 37°, а затем поступают так, как при определении ОИ.
Титр опсонинов (ТО) количественно характеризует силу опсонической активности по отношению к специфическому возбудителю. В отличие от ОФИ здесь исключается влияние изменений со стороны фагоцитов, т.к. в опыт берут лейкоциты или макрофаги здорового человека.