Внутрикожная проба для выявления антитоксического иммунитета

 Помимо углеводов для токсинообразования
необходимы в минимальных дозах некоторые
металлы. Токсинообразование дифтерийной
палочки тормозится избытком железа в среде
в равной мере как и отсутствием его.
При наличии в среде оптимальных количеств
железа токсинообразование резко усиливается.

 Токсинообразование осуществляется
в полную меру при определенном рН среды.
Между тем в процессе роста культуры
значение рН изменяется и может достигнуть
таких показателей, которые будут тормозить
образование токсина.

 Для устранения этого в среды 
добавляются буферные вещества,
поддерживающие нужное значение 
рН. Одним из таких веществ, обладающих 
свойствами буфера, является уксусно-кислый
натр, который добавляется в бульон в количестве
0,5-0,75 %.

 В зависимости от биологических 
особенностей микроба-токсинообразователя
применяются разные условия выращивания
и, в частности, регулируется аэрация
среды. Дифтерийная палочка образует токсин
в условиях максимальной аэрации, наоборот,
столбнячная палочка и другие токсигенные
анаэробы в кислороде не нуждаются. В соответствии
с этим в первом случае культура выращивается
в тонком слое среды с большой поверхностью
соприкосновения с воздухом, во втором
— среда наливается высоким слоем и в нее
добавляются различные адсорбенты кислорода
(вата, сухие эритроциты).

 Температура выращивания и длительность 
его варьируют для разных микробов.
Общей для процесса токсинообразования
является необходимость безукоризненной
регулировки температуры в термостате.
Колебания температуры отрицательно сказываются
на силе токсина. Поэтому термостаты, в которых
происходит токсинообразование, снабжаются
точными терморегуляторами.

 В каждом отдельном случае 
длительность выращивания культуры 
определяется интенсивностью токсинообразования
на данной серии среды. Для решения вопроса
о времени прекращения культивирования
производят определение силы токсина
и рН среды в разные сроки выращивания.

 Когда сила токсина достигает 
максимума, производят отделение 
его от микробных тел, это производится 
путем фильтрации через специальные 
бактериальные фильтры (анаэробные 
микроорганизмы) или обычные бумажные
(дифтерийная палочка).

 Перевод токсических фильтратов 
в анатоксин осуществляется путем
длительного воздействия на них формалина
при температуре 39-40 °С. Формалин соединяется
свободными аминогруппами аминокислот,
полипептидов и белков токсина, в связи
с чем, утрачивает свои ядовитые свойства.
Переход токсина в анатоксин происходит
в течение 3-4 недель. Для правильного
анатоксинообразования имеет значение
рН токсина. Наиболее благоприятной является
нейтральная или слабощелочная реакция
среды.

 Анатоксины характеризуются 
полной безвредностью для животных.
Однако при неполном обезвреживании 
в них могут сохраняться остатки 
токсина, которые вызывают в чувствительном 
организме поздние повреждения.
Поэтому при проверке безвредности 
анатоксинов наблюдение за животными 
ведут в течение длительного 
времени. Безвредность анатоксинов 
необратима. Никакие воздействия 
не приводят к восстановлению 
утраченной токсичности.

 Анатоксины сохраняют почти 
в полной мере антигенные свойства 
токсинов. Это может быть проверено 
различными методами в пробирке
(реакция флокуляции, реакция связывания
анатоксина) и в опытах на животных,
у которых введение анатоксина вызывает
образование соответствующих антитоксинов
и создание антитоксического иммунитета.

 Анатоксины отличаются стойкостью;
они переносят повторное замораживание 
и оттаивание, противостоят действию 
высокой температуры и стабильны 
при длительном хранении.

 Анатоксины содержат помимо 
специфических белков также балластные 
вещества, от которых они могут 
быть освобождены разными методами.
Они основаны на способности 
анатоксинов осаждаться при насыщении
нейтральными солями, солями тяжелых металлов,
кислотами (соляной, трихлоруксусной,
метафосфорной), а также в присутствии
этилового и метилового спирта при низкой
температуре. Эти методы используются
в настоящее время для получения очищенных
концентрированных анатоксинов.

 Анатоксины адсорбируются на 
различных нерастворимых веществах
(фосфорные соли, гидроокись алюминия),
это используется для приготовления 
сорбированных анатоксинов, которые 
отличаются замедленной всасываемостью 
в организме, в результате чего 
можно получить более напряженный 
иммунитет.

 Благодаря своей безвредности,
высокой антигенности и иммуногенности,
анатоксины являются ценнейшими средствами
профилактики и терапии ряда заболеваний.

 В настоящее время получены 
анатоксины: дифтерийный, столбнячный,
ботулинический, стафилококковый, дизентерийный,
из токсинов, продуцируемых возбудителями 
газовой гангрены, а также из 
змеиного яда.

КОЖНЫЕ РЕАКЦИИ

• с токсином:

Проба
Дика — внутрикожный тест на присутствие
в организме Ат против эритрогенного токсина
S. pyogenes. Для постановки Д. п. внутрь кожи
ладонной поверхности предплечья вводят
0,1 мл стандартного эритрогенного токсина.
За положительную реакцию принимают появление
через 1 — 4 ч на месте введения токсина
воспалительного инфильтрата диаметром
в 10 мм и более. Положительная проба указывает
на восприимчивость человека к скарлатине,
отрицательная — на наличие иммунитета.

Реакция
Шика — внутрикожная проба с дифтерийным
токсином, применяемая для установления
противодифтерийного иммунитета. Для
постановки Ш.р. внутрь кожи ладонной поверхности
предплечья туберкулиновым шприцем вводят
0,2 мл стандартного дифтерийного токсина,
содержащего 1/64 ДЛМ для морской свинки.
Результат учитывают через 72 — 96 ч. У людей,
не имеющих Ат против токсина или имеющих
их мало, на месте введения образуются
краснота и инфильтрат (положительная
реакция); у людей, в с-ке к-рых содержатся
антитоксические Ат в концентрации 1 /30
АЕ и больше, инфильтрат не развивается
или он меньше 1 см (отрицательная реакция).
Результаты Ш.р. используют для оценки
коллективного иммунитета и проведения
профилактических прививок. В настоящее
время с этой целью применяют РПГА с эритроцитарным
диагностикумом.

• со взвесью микроорганизмов:

Проба Бюрне — Аллергическая кожная проба
(Бюрне) нашла широкое применение. Проба
вполне специфична и отличается весьма
высокой чувствительностью. Определяет
способность организма, зараженного бруцеллезом,
специфически отвечать местной реакцией
кожи на внутрикожное введение бруцеллина
— фильтра 3-недельного роста бульонной
культуры бруцелл любого типа. Реакция
становится положительной на 3—4-й неделе
от начала болезни, но бывают случаи и
более раннего появления. В дальнейшем
она сохраняется с большим постоянством
на протяжении очень длительного периода
(иногда до нескольких лет), даже после
полного клинического выздоровления.

Нередко диагноз бруцеллеза
ставится только на основании положительной
реакции Бюрне при отрицательных серологических
данных. В этих случаях необходим особенно
тщательный дифференциально-диагностический
подход к вопросу, чтобы исключить всевозможные
заболевания с аналогичной клинической
картиной.

В эпидемических очагах реакция
Бюрне может быть положительной у людей,
никогда не болевших клинически выраженным
бруцеллезом. Положительный результат
реакции Бюрне еще не является доказательством
активного бруцеллеза и в то же время не
исключает другого заболевания.

Для постановки реакции Бюрне
бруцеллин в дозе 0,1 мл вводят строго внутрикожно
в среднюю треть ладонной поверхности
предплечья. Через 6—12 часов на месте инъекции
появляется отек и покраснение, которые
достигают максимального развития через
24 и 48 часов, после чего постепенно угасают.
Однако необходимо помнить, что в редких
случаях внутрикожная проба становится
положительной к 72 часам — это так называемые
поздние реакции. При оценке реакции принимают
во внимание главным образом воспалительный
болезненный отек; гиперемия кожи на месте
инъекции без отека диагностического
значения не имеет. Отсутствие болезненности
и изменение цвета кожи, обычно сопровождающих
отек, не исключает положительной оценки
пробы.

Обычно в практике интенсивность
реакции учитывается соответственно рекомендации
Б. П. Первушина (1947) следующим образом:
1) отрицательная реакция (—) — полное
отсутствие местных изменений; 2) сомнительная
реакция (±) — наличие асимметрии кожной
складки по сравнению с контрольной; 3)
слабо положительная ( + )—наличие слабо
выраженного отека и красноты диаметром
2—3 см; 4) положительная реакция ( + + )—наличие
отечности диаметром 4—5 см, иногда с аденитом;
5) резко положительная (+ + + ) —при отеке
6—8 см с аденитом.

Степень интенсивности внутрикожной
аллергической реакции в основном зависит
от индивидуальной чувствительности организма.

Реакция на введение бруцеллина
обычно ограничивается только местными
явлениями, общая реакция, как правило,
отсутствует, но в редких случаях у высокосенсибилизированных
лиц местная реакция сопровождается лимфангитом,
иногда повышением температуры, головной
болью, общим недомоганием.

Интенсивность кожной реакции
в течение бруцеллеза варьирует в широких
пределах. Время угасания кожной сверхчувствительности
к бруцеллину может быть обусловлено и
такими факторами, как интеркуррентное
заболевание, интоксикация, охлаждение
и т. д. Н. Д. Беклемишев (1965) наблюдал десенсибилизацию
под влиянием солнечных ванн, физиопроцедур.

Динамичность реакции Бюрне,
по данным Б. П. Первушина (1962), отражает
иммунологическое состояние организма,
и сохранение ее в течение длительного
времени свидетельствует о высокой резистентности
организма к суперинфекции. Нами аллергическая
проба Бюрне была проведена в стационаре
у 265 детей. Полученные результаты представлены
в табл. 6, причем сомнительные результаты
объединены с отрицательными, слабо положительные—
с положительными.

Из приведенных данных видно,
что положительные результаты реакции
Бюрне могут наблюдаться при всех формах
бруцеллеза, но с наибольшей частотой
они встречаются при хронических формах
бруцеллеза.

Необходимо иметь в виду, что
реакция Бюрне становится положительной
и после вакцинации живой бруцеллезной
вакциной. Она появляется через 1 — 1,5 месяца
после вакцинации, бывает ясно выраженной
в период от 2—3 до 12—13 месяцев, после чего
начинает угасать.

Проба
Манту — метод исследования напряженности
иммунитета к возбудителю туберкулеза
с помощью оценки реакции на специальный
препарат микобактерий, туберкулин.

      История туберкулинодиагностики

      Туберкулин 
в его классическом виде был 
изобретен в 1890 известным немецким 
врачом Робертом Кохом, именем 
которого назван и возбудитель 
туберкулеза — палочка Коха.

      Авторство 
метода туберкулинодиагностики, то
есть применения туберкулина Коха с целью
диагностики, принадлежит Пирке, который
в 1907 году впервые предложил применять
туберкулин для диагностики туберкулеза.
На поврежденную специальным бориком
кожу наносился туберкулин. Позднее этот
метод был модифицирован и повреждение
кожи (скарификацию) стали производить
специальным ланцетом. Приблизительно
в таком виде проба Пирке дошла и до нынешних
дней.

      Несколько 
позже французский врач Манту
(Mantoux) предложил другую модификацию пробы
— внутрикожное введение туберкулина.
Проба в модификации Манту применяется
в России с 1965 года.

      Что такое туберкулин?

      Смысл туберкулина
— «обозначить» в организме присутствие 
туберкулезной палочки с тем,
чтобы можно было оценивать 
реакцию организма (качественно 
и количественно) на это «присутствие».
В этом смысле туберкулин отлично 
справляется со своей задачей
— именно по этой причине препарат 
так и не был подвергнут 
коренной переработке и вот 
уже более 100 лет, до настоящего 
дня является одним из основных 
средств диагностики туберкулеза.

      И опять 
немного истории. Туберкулин (точное 
название «альттуберкулин», АТ) Коха
— это «вытяжка», лизат из микобактерий
туберкулеза, инактивированных нагреванием.
Классический препарат, помимо самого
туберкулина, содержал много примесей
— остатки питательной среды, на которой
выращивали бактерии, соли и другие вещества,
влиявшие на чистоту реакции и затруднявшие
оценку результата проб. С конца 60-х годов
20-го столетия были разработаны более
чистые препараты туберкулина, так называемые
PPD (Purified Protein Derivate — очищенный дериват белка),
которые применяются и по сей день. В России
применяется препарат ППД-Л, т.е. очищенный
туберкулин, полученный русским ученым
Линниковой в 1965 году. Современный препарат
туберкулина, помимо самого туберкулина,
содержит соли фосфатного буферного раствора,
натрия хлорид, стабилизатор Твин-80, и
фенол в качестве консерванта. В основном
препарат избавлен от балластных примесей,
однако он может содержать их в следовых
количествах, что может влиять на результат
реакции.

      Однако 
до конца до сих пор неизвестен 
в точности механизм взаимодействия 
туберкулина с иммунной системой.
С одной стороны, лизат белков (пептиды,
аминокислоты) не может являться полноценным
антигеном. И действительно, туберкулин
не вызывает образования иммунитета. Но
эта точка зрения не объясняет усиления,
как при вакцинации, реакции при частой
постановки пробы — т.н. «бустерный эффект»
пробы Манту. Так что же такое туберкулин?
Скорее всего, туберкулин можно охарактеризовать
как разнородную смесь из органических
веществ разной степени сложности, полученных
из микобактерий.