Диагностика иммунитета к гриппу
Вирус гриппа эпителиотропен. Патогенез заболевания обусловлен токсическим воздействием вируса и продуктов распада клеток на нервную и сосудистую систему с расстройством гемодинамики, микроциркуляции, гипоксией. Это приводит к дистрофическим изменениям в миокарде, в нейроэндокринной системе, активизации тромбообразования, нарушениям электролитного баланса и кислотно-основного равновесия.
Входными воротами инфекции является респираторный тракт. Вирус гриппа реплицируется и репродуцируется в эпителиальных клетках слизистой оболочки, вызывая дегенерацию эпителиоцитов с развитием некроза и отторжением клеток, что облегчает процесс присоединения вторичной бактериальной инфекции.
Патологический процесс при гриппе развивается быстро. Вслед за фазой репродукции вируса в клетках дыхательных путей развивается фаза вирусемии с характерными токсическими и токсико-аллергическими реакциями со стороны внутренних органов, прежде всего сосудистой и нервной систем. Результатом вирусемии, длящейся, как правило, 10-14 дней, является проникновение возбудителя во внутренние органы. Вирусный антиген определяется в крови, селезенке, лимфатических узлах, миндалинах и ткани головного мозга.
Главным звеном в патогенезе гриппа является поражение сосудистой системы. Оно возникает вследствие токсического действия вируса и проявляется повышением проницаемости сосудов, ломкостью их стенок, нарушением микроциркуляции. Эти изменения обусловливают появление у больных носовых кровотечений, геморрагической сыпи на коже и слизистых, кровоизлияний во внутренние органы.
Резкое падение тонуса сосудов приводит к возникновению венозной гиперемии кожи и слизистых, застойному полнокровию внутренних органов, нарушению микроциркуляции и диапедезным кровоизлияниям, а в более поздние сроки — тромбозу вен, капилляров и крупных сосудов.
Падение тонуса мелких сосудов и повышение их проницаемости приводит к развитию ранних изменений в легких: отеку легочной ткани и множественным кровоизлияниям в альвеолы и интерстиций легкого.
Нарушение проницаемости сосудов и токсическое влияние вируса на рецепторы сосудистого сплетения мозга вызывают гиперсекрецию спинномозговой жидкости с развитием циркуляторных расстройств, приводят к внутричерепной гипертензии и отеку мозга.
В основе сложного комплекса функциональных расстройств нервной системы лежит также поражение вегетативной нервной системы и зоны межуточного мозга (гипоталамус, гипофиз), как области наиболее высокой васкуляризации, обеспечивающей нейровегетативную, нейроэндокринную и нейрогуморальную регуляцию.
В развитии осложнений играет роль воздействие гемагглютинина вируса, что проявляется поражением эритроцитов, активизацией внутрисосудистого тромбообразования с развитием ДВС-синдрома. Также развитие синдрома интоксикации и токсико-аллергических реакций наряду с воздействием гемагглютинина вируса и накапливающихся при распаде клеток биологически активных веществ (простагландины, серотонин, гистамин) приводят к нарушениям реологических свойств крови, а в некоторых случаях — развитию инфекционно-токсического шока.
Расстройства микроциркуляции, электролитного баланса и КЩС лежат в основе развития отека мозга и легких, дистрофических изменений в миокарде.
Грипп обуславливает снижение иммунологической реактивности, что приводит к обострению различных хронических заболеваний, а также облегчает присоединение вторичной бактериальной инфекции с развитием бактериальных осложнений (пневмонии, синуситы, бронхиты, отиты).
Выздоровлению способствуют процессы, протекающие на уровне слизистой оболочки дыхательных путей, препятствующие дальнейшему распространению вируса вируса: синтез интерферона инфицированными клетками, накопление секреторных YgA и неспецифических термолабильных В-ингибиторов. Сопровождающая заболевание лихорадочная реакция, повышает активность синтеза антител, интерферона, а также Т-киллеров, уничтожающих пораженные вирусом клетки.
Грипп — острая респираторная вирусная инфекция, вызванная вирусами группы А, В или С, протекающая с тяжелым токсикозом, лихорадкой, поражением верхних и нижних дыхательных путей.
Грипп часто дает осложнения вплоть до летального исхода, вызывает эпидемии.
Выделяется три группы вируса:
- группа А с многочисленными штаммами. Обладает тяжелым течением, высоким процентом осложнений, сильно мутирует.
- группа В – протекает относительно нетяжело, редко дает осложнения, сильно мутирует.
- группа С – протекает относительно легко, практически не мутирует, возникает в основном у детей.
Вирус гриппа относится к группе ОРВИ, имеет схожее с ними распространение, сезонность и течение, но обладает более выраженными клиническими проявлениями, течением и исходами.
Грипп склонен к эпидемическому распространению. Источник инфекции – больные люди в периоде инкубации и разгара. Заражение происходит воздушно-капельным путем, от момента заражения до клинических проявлений проходит от 6 часов до 2-х суток. Проникает вирус через слизистые оболочки глаз, дыхательных путей. Реже заражение происходит через общие предметы гигиены и посуду.
Начало гриппа острое с резким недомоганием, повышением температуры до высоких цифр, иногда до 39-40°C. В начале также отмечается сильный озноб, интоксикация, катаральные явления (покраснение, боль в горле).
Возникает сильная головная боль, с локализаций в области лба и носа, усиливается при движении глаз. Возникает сильная слабость, мышечная ломота, боли в пояснице и суставах, нарушение аппетита с тошнотой. Лихорадка сохраняется до3-5 суток.
Также появляются насморк и боли в горле, сухость и першение, сухой кашель без мокроты, рези в глазах, их краснота, слезотечение, осиплость голоса и заложенность ушей.
Также при тяжелом гриппе могут возникать геморрагические проявления – расширение сосудов на склерах, мелкие кровоизлияния, носовые кровотечения, краснота лица на фоне общей бледности, кровоизлияния на коже в виде мелких точек.
В тяжелых случаях возникают лихорадка за 40°C, резкие головные боли с рвотой, одышка шумным дыханием, забытье и бред, нарушение сознания, судороги, геморрагические высыпания на коже.
Особенно тяжело грипп протекает у детей первых двух лет, ослабленных больных, беременных и пожилых людей.
Основа диагноза гриппа – типичная клиника с указанием на эпидемические данные. Подтверждает диагноз гриппа мазок-отпечаток с горла и носа с выделением штамма вируса. В период эпидемии гриппа диагноз ставится на основании клинических данных.
Одни и те же симптомы могут быть признаками разных заболеваний, а болезнь может протекать не по учебнику. Не пытайтесь лечиться сами — посоветуйтесь с врачом.
Общие принципы лечения гриппа сходны с лечением ОРВИ, но в месте с тем показан прием противовирусных препаратов – ремантадина, озельтамивира, амантадина, занамивира.
Показан постельный режим, жаропонижающие препараты, обильное питье, диета, препараты интерферона, симптоматическая терапия по показаниям.
В тяжелых случаях показан специфический противогриппозный иммуноглобулин.
- Амантадин и ремантадин эффективны только в отношении вируса гриппа А при условии начала лечения в первые 48 часов после появления первых признаков заболевания. Препараты вызывают укорочение лихорадочного периода, ослабление проявлений гриппа. В последние годы отмечается устойчивость возбудителя гриппа к ремантадину.
- Тамифлю зарекомендовал себя как высокоэффективный и безопасный препарат. В клинических исследованиях показано, что препарат хорошо проникает в основные очаги инфекции, в том числе в легкие, среднее ухо, пазухи носа, характеризуется хорошей переносимостью как детьми, так и взрослыми всех возрастных групп. Эффективность тамифлю в значительной степени зависит от сроков его приема – при начале лечения в первые 12 часов после появления лихорадки средняя продолжительность гриппа уменьшается на 3 дня в сравнении с более поздно начатой терапией. Рано начатое лечение приводило также к быстрому исчезновению интоксикации, достоверному уменьшению длительности лихорадки и тяжести гриппа.
- Противогриппозный иммуноглобулин 0,2 мл/кг (для лечения и профилактики гриппа у детей раннего возраста).
- Сосудосуживающие средства местно для облегчения носового дыхания. Нафазолин – взрослым по 1–3 капли 0,05% р-ра в каждую половину носа каждые 4-6 ч. или ксилометазолин в каждую половину носа по 1–3 капли 0,1% р-ра 1–3 р./сут. (взрослым) или по 1 капле 0,1% р-ра 1 р./сут. (детям от 2 до 12 лет).
- Витамины (аскорбиновая кислота, рутозид).
В неосложненных случаях наступает полное выздоровление. Осложненный грипп может привести к смерти.
Вакцинация от гриппа – это способ профилактики инфекции. Показана она всем, особенно группам риска – пожилым, детям, беременным, людям социальных профессий.
Вакцинация проводится ежегодно, перед началом эпидемического сезона, с сентября-октября, для формирования стойкого иммунитета к моменту эпидемии. Постоянная вакцинация повышает эффективность защиты и выработку антител к гриппу.
Существует три вида вакцин.
- Цельновирусные, они могут быть как живыми, так и инактивированными (убитыми). Показаны для вакцинации взрослых и здоровых людей, имеют недорогую стоимость, эффективны в плане формирования иммунитета, но при введении дают высокий процент побочных эффектов, часто вызывают лихорадку, недомогание и головные боли.
- Субъединичные вакцины – это вакцины, содержащие не полные вирусные частицы, а только фрагменты молекулы, на которые иммунная система формирует иммунитет к гриппу. Они стоят дороже, но и переносятся гораздо лучше цельновирусных. Однако стоит помнить, что вирус имеет специфику мутировать, и вакцины могут терять эффективность.
- Сплит-вакцины – содержат фрагменты убитых вирусов гриппа как их нестабильной и мутирующей оболочки, так и из цельной и постоянной сердцевины вируса. Они наиболее дорогие, но на сегодня самые эффективные, дают минимальное количество побочных эффектов и обладают самой высокой эффективностью.
Субъединичные и сплит-вакцины можно применять у детей, ослабленных больных и беременных. Они применяются внутримышечно или подкожно. Вакцинация особенно эффективна в период до начала эпидемии, с сентября по начало декабря. В дальнейшем вакцинация также применима. Но дополнительно показана профилактика гриппа ремантадином.
При введении вакцины могут отмечаться местные (отек и краснота в месте укола) и общие реакции (недомогание, сонливость, легкая температура).
Запрещена вакцинация при острых инфекциях, обострении хронической патологии и при аллергии на белок куриного яйца, при предыдущих негативных реакциях на вакцинацию.
Помимо вакцинации существует и другая профилактика гриппа – это отказ от посещения людных мест в период эпидемии. Необходимо мытье рук, регулярное промывание и увлажнение слизистой носа, полоскании рта, прием иммуностимуляторов и повышенных доз витамина С.
В период эпидемий важно полноценное питание, теплая одежда для профилактики переохлаждения, регулярное пребывание на свежем воздухе и физические упражнения. Необходим полноценный отдых и сон, отказ от курения и алкоголя, профилактика стрессов.
Применение оксолиновой или вифероновой мази, прием противовирусных препаратов (арбидола, ремантадина, анаферона), закапывание гриппферона не имеет достаточной доказательной базы и не влияет на прогноз заболевания, а результат применения сравним с эффектом плацебо.
Возбудители гриппа – РНК-содержащие вирусы, относятся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют три рода – Influenzavirus A, Influenzavirus В и Influenzavirus С, каждый из которых имеет по одному виду – Influenza A virus, Influenza В virus и Influenza С virus. Вирусы гриппа А и В ежегодно вызывают эпидемии большей или меньшей интенсивности практически во всех странах мира. Вирусы гриппа А широко распространены в природе, их выделяют от большинства зверей и птиц, в связи с чем они имеют высокий пандемический потенциал, так как способны преодолевать межвидовые барьеры. Вирусы гриппа В выделяли только от людей. Вирусы гриппа С вызывают спорадические заболевания в форме ОРЗ. Вирусы гриппа А, В и С дифференцируют друг от друга с помощью иммунологических и молекулярно-генетических методов. Вирусы гриппа А дополнительно типируют на подтипы (или субтипы) в соответствии с антигенной структурой поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина – на 16 субтипов и нейраминидазы – на 9 субтипов.
Эпидемии гриппа отличает высокая смертность, варьирующая среди разных возрастных групп и достигающая максимума у детей до 5 лет, пожилых людей и лиц с хроническими заболеваниями органов дыхания и сердечно-сосудистой системы. Однако во время пандемии гриппа в 2009 г., вызванной так называемым «свиным гриппом» А/H1N1pdm2009 (или A/H1N1sw2009), наибольший уровень летальности отмечался среди лиц от 30 до 64 лет. К группе риска относились лица, страдающие ожирением, заболеваниями сердечно-сосудистой системы и беременные женщины.
После перенесенного гриппа нередко наблюдаются осложнения в виде отитов и синуситов, пневмонии, вследствие присоединения бактериальных инфекций. Наиболее опасен грипп возможным быстрым развитием вирусной пневмонии с геморрагическим синдромом, приводящей к острой дыхательной недостаточности, что характерно для гриппа А/H1N1pdm2009. Дифференциальная диагностика гриппа и других ОРВИ возможна только с помощью лабораторных методов исследования.
Показания к обследованию. Острое начало с высокой лихорадкой (выше 38°С), продолжающейся до 3-х дней и синдромом интоксикации (головная боль преимущественно в области лба, боль в глазных яблоках, ломота в мышцах, сильная слабость) с последующим развитием катаральных явлений.
Материал для исследований
- Мазки из носоглотки – культуральное исследование, обнаружение АГ;
- мокрота, плевральная жидкость, аспираты из зева, БАЛ – выявление РНК вирусов (поражение нижних дыхательных путей);
- мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки – выявление РНК вирусов (поражение верхних дыхательных путей);
- сыворотка крови – обнаружение АТ.
Этиологическая лабораторная диагностика включает культуральное исследование, выявление РНК возбудителей и их АГ, обнаружение специфических АТ.
Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Культуральное исследование основано на изоляции вирусов в живых культурах клеток млекопитающих или на развивающихся куриных эмбрионах с последующим определением активности гемагглютинации (агглютинации вирусами эритроцитов) и идентификацией субтипов гемагглютинина в реакции торможения гемагглютинации с типоспецифическими сыворотками. Методы отличаются трудоемкостью и длительностью, во многом зависят от качества не стандартизованных реагентов, в связи с чем для рутинной диагностики практически не используется, но применяется в эпидемиологических исследованиях.
Для обнаружения АГ вирусов гриппа применяют методы ИХА, ИФА, РИФ (МФА). Метод РИФ обладает низкой чувствительностью, недостаточной специфичностью и отличается субъективностью при интерпретации результатов анализа. При использовании ИХА велика вероятность ложноположительных результатов вне эпидемического подъема гриппа и ложноотрицательных – во время эпидемического подъема. Кроме того, быстрые тесты на основе РИФ и ИХА характеризуются низкой чувствительностью к пандемическому, так называемому «свиному» гриппу (40–60%). В связи с чем CDC для быстрой диагностики нового варианта гриппа А/H1N1pdm2009 рекомендовал использовать выявление РНК вируса методом ПЦР.
Использование в качестве мишени специфичных консервативных участков генома вирусов гриппа обуславливает высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности ПЦР, приближающихся к 100% по сравнению с культуральной диагностикой. Преимуществами такого способа диагностики являются короткие сроки выполнения анализа, а также возможность типирования вирусов гриппа А и В и идентификации субтипа вирусов гриппа А, в том числе – нового пандемического варианта «свиного» вируса гриппа. Максимальный уровень специфичности и чувствительности имеют наборы реагентов с использованием ПЦР в режиме «реального времени».
При выявлении специфических АТ оценивают нарастание их титра в образцах крови полученных с интервалом в 2 недели (парные сыворотки) с использованием методов РТГА, РСК. Результаты в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациента.
Показания к применению различных лабораторных исследований. Выявление РНК вирусов гриппа методом ПЦР используется для быстрой этиологической диагностики гриппа и скрининга клинического материала в целях эпидемиологического надзора. Выявление АТ используется для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективной диагностики и ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек гриппа.
Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Исследования методом ПЦР позволяют обнаружить РНК вируса гриппа А, В или С и/или определить подтип вируса гриппа А. Несоблюдение техники получения мазков из носоглотки и ротоглотки или использование данного материала при диагностике вирусной пневмонии, может сильно снизить информативность исследования вплоть до получения отрицательного результата.
Учитывая возможность сочетанного инфицирования вирусами гриппа и другими возбудителями ОРЗ, желательно проведение исследования полного спектра возбудителей.
В связи с недостаточной чувствительностью тестов для выявления АГ методами РИФ и ИХА получение отрицательных результатов при их использовании не исключает возможного инфицирования.
Приложение
к письму Минздрава России
от 06.03.2017 г. N 27-3/548
Методические рекомендации
(MP) разработаны ФГБУ «НИИ гриппа» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (авторский коллектив: д.м.н., проф.
А.А.Соминина, О.С.Коншина, Е.М.Войцеховская, к.б.н. Е.В.Кузнецова,
к.м.н. B.C.Вакин, к.м.н. Е.А.Смородинцева).
21 ноября 2016 г.
Введены впервые.
Аннотация
Контроль за состоянием
противогриппозного популяционного иммунитета (ПИ), являющегося
следствием естественной циркуляции вирусов гриппа и вакцинации,
имеет важное значение для определения пропорции восприимчивого
населения к постоянно меняющимся циркулирующим вирусам гриппа и
прогнозирования этиологии и тяжести предстоящих сезонных эпидемий.
В последние годы установлены корреляции между уровнем ПИ и тяжестью
эпидемий в отдельных городах страны. Низкий уровень ПИ является
фактором риска быстрого развития тяжелых эпидемий. Кроме того, ПИ
является чутким индикатором начала циркуляции нового пандемического
вируса, как это было установлено в 2009 г.
Определение уровня
популяционного иммунитета является составной частью традиционного
надзора за гриппом. В соответствии с действующей системой надзора
(Приказ Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 31
марта 2005 г. N 373) надзор за гриппом осуществляется на
регулярной основе в ряде региональных опорных баз (ОБ) —
Федеральных бюджетных учреждениях здравоохранения «Центр гигиены и
эпидемиологии» (ФБУЗ ЦГиЭ), сотрудничающих с Федеральным центром по
гриппу и ОРЗ (ФЦГ) и Национальным центром по гриппу ВОЗ (НЦГ) при
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства
здравоохранения Российской Федерации. Исследованию подлежат
сыворотки здоровых доноров крови в возрасте от 18 до 60 лет.
Исследования проводятся дважды в год — в предэпидемический период
(октябрь) и постэпидемический период (апрель). Каждая ОБ исследует
по 100 сывороток доноров в указанные выше сроки. Результаты в виде
протоколов исследований представляются в ФГБУ «НИИ гриппа»
Минздрава России, где они обрабатываются и анализируются.
В
целях стандартизации исследований и приведения их в соответствие
международным требованиям при подготовке настоящих Методических
рекомендаций были использованы разделы Руководства ВОЗ (WHO Global
Influenza Surveillance Network: Manual for the laboratory diagnosis
and virological surveillance of influenza, 2011) и российские
стандарты постановки РТГА (МУ
3.3.2.1758-03, Методы определения показателей качества
иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики
гриппа).
1.
Область применения
1.1. Метод
предназначен для определения уровня популяционного иммунитета к
вирусам гриппа в предэпидемический по гриппу период и по окончании
эпидемии путем выявления антител к сезонным вирусам гриппа
A(H1N1)pdm09, A(H3N2), В (Викторианской и Ямагатской линий) с
последующими расчетами средних геометрических титров антител и
процента серонегативных лиц к каждому из возбудителей.
1.2. В случае
регистрации появления на эпидемической орбите потенциально
пандемических вирусов или вспышек неясной этиологии метод
рекомендуется использовать для обнаружения антител к известным,
патогенным для человека и животных вирусам гриппа A(H5N1), A(H5N6),
A(H5N8), A(H2N2), A(H7N9), A(H9N2) с использованием диагностических
препаратов, разработанных в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России.
2.
Введение
Популяционный иммунитет
(ПИ) основной массы взрослого населения в возрасте 18-60 лет к
современным вирусам гриппа, являющийся отражением их циркуляции на
территории страны и активной иммунизации населения гриппозными
вакцинами, служит одним из основных факторов, влияющих на развитие,
этиологию и тяжесть эпидемий.
Исследования сывороток
взрослых доноров позволяют оценить уровень ПИ в реакции торможения
гемагглютинации (РТГА), по результатам которой определяют средние
геометрические титры (СГТ) антител и процент восприимчивого
населения (серонегативных лиц) к циркулирующим вирусам.
При постановке РТГА
рекомендуется применение единой методологии с использованием
стандартизованных препаратов гриппозных диагностикумов,
резистентных к неспецифическим ингибиторам сывороток человека, а в
качестве контроля их активности и специфичности — диагностических
сывороток, содержащих антитела к антигенно актуальным вирусам
гриппа. Для обеспечения специфичности реакции рекомендуется
использование исключительно куриных эритроцитов.
3.
Описание метода
3.1
Преимущества метода
—
РТГА проста в исполнении, экономична и обеспечивает возможность
быстрого определения специфических антител к различным субтипам
возбудителей сезонных эпидемий и потенциально пандемическим
вирусам.
—
Метод рекомендован ВОЗ также для оценки иммуногенности гриппозных
вакцин.
—
Защитными титрами антител, обеспечивающими защиту от гриппа в 50%
случаев, принято считать титры в РТГА, равные 1:32 и выше.
—
Метод может быть использован в практических вирусологических
лабораториях, что позволяет определять содержание противовирусных
антител в сыворотках людей в непосредственной близости к очагам
необычных вспышек респираторных заболеваний.
3.2
Показания и противопоказания к применению метода
Показания к применению
метода:
—
Определение уровня популяционного иммунитета взрослого населения к
современным штаммам вируса гриппа.
—
Расшифровка этиологии вспышек респираторных заболеваний, вызванных
вирусами, которые не удается идентифицировать традиционными
методами (ПЦР, иммунофлуоресцентный анализ) при использовании
препаратов для детекции потенциально пандемических вирусов
гриппа.
—
Раннее распознавание распространения в популяции нового
пандемического штамма вируса.
Противопоказания:
Отсутствие материально-технического обеспечения
3.3
Материально-техническое обеспечение
3.3.1.
Материалы
—
Планшеты круглодонные для иммунологических реакций
—
Эритроциты кур
—
Фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,4±0,2 (ФСБ)
—
Раствор лимоннокислого натрия
—
Вода дистиллированная ГОСТ
6709-72
—
Наконечники к дозаторам, стерильные, одноразовые
—
Пробирки с пробками, объемом 5 мл, стерильные, одноразовые
—
Диагностикумы гриппозные для реакции торможения гемагглютинации
сухие, РУ N ФСР 2009/05253 от 09.07.2009 г.;
—
Сыворотка диагностическая гриппозная для реакции торможения
гемагглютинации сухая (СДГ), РУ N ФСР 2009/05257 от 09.07.2009
г.
3.3.2.
Оборудование
—
Ламинарный бокс 2 класса защиты
—
Дозатор одноканальный, со сменным объемом 20-200 мкл,
—
Дозатор одноканальный, со сменным объемом 100-1000 мкл
—
Дозатор одноканальный, со сменным объемом 1000-5000 мкл
—
Дозатор 8-канальный, со сменным объемом 20-200 мкл
—
Дозатор 12-канальный, со сменным объемом 20-200 мкл
—
Рефрижератор (4°С) с морозильной камерой (-25°С) для хранения
сывороток доноров
—
Центрифуга лабораторная (до 3000 об/мин)
—
Баня водяная
3.3.3. Приготовление
растворов
3.3.3.1.
Фосфатно-солевой буферный раствор (0,01 М, рН 7,4±0,2)
а) Растворить
последовательно 38,25 г натрия хлористого и 7,12 г натрия
фосфорнокислого двузамещенного в 4,5 л дистиллированной воды
(раствор А).