Методы оценки клеточного иммунитета
Первым исследованием всегда является подсчет лейкоцитарной формулы (см. главу «Гематологические исследования»). Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови.
Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ). Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы ВОЗ рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).
Метод исследования
Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.
Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.
Условия взятия и хранения образцов
Венозная кровь, взятая из локтевой вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.
Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.
Интерпретация результатов
Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.
Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.
В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.
Увеличение отмечается при аутоиммунных заболеваниях, хронических заболеваниях печени, циррозе, муковисцедозе, бронхиальной астме, паразитарных и грибковых инфекциях. Характерно в период реконвалесценции после перенесенных острых и хронических вирусных и бактериальных инфекций. Выраженное увеличение наблюдается при хроническом В-лимфолейкозе.
NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.
Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.
Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах, паразитарных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, облучении, лечении цитостатиками и кортикостероидами, стрессе, дефиците цинка.
Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.
Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.
Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.
Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.
Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).
Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.
Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.
Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.
Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.
ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.
Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.
Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.
Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.
Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.
Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.
Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.
Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.
Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.
Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.
Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.
Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.
Еще несколько лет назад не были известны методы, с помощью которых можно было бы оценить реакции клеточного иммунитета in vitro. В настоящее время эти методы разработаны, усовершенствованы и широко используются в клинической иммунологии. Следует отметить четыре направления для оценки Т-звена иммунной системы: 1 — доказательство непосредственной реакции между Т-клеткой и антигеном; 2 — выявление характерных изменений Т-клетки под влиянием антигенного стимула; 3 — определение активности медиаторов иммунного ответа как проявление реакции между Т-клеткой и антигеном; 4 — доказательство воздействия Т-лимфоцитов на антигенсодержащие клетки.
Связывание антигена на лимфоцитах. Эта самая распространенная техника предполагает использование меченого антигена (радиоактивная или флюоресцентная метка). Присутствие антигена на поверхности лимфоидных клеток определяют с учетом необходимых приемов контроля. Предварительная обработка эритроцитов исследуемым антигеном дает возможность оценки антигеннесущих лимфоцитов в специфической реакции розеткообразования. Эти методы назначают при ревматоидном артрите (эритроциты, обработанные экстрактом, полученным из синовиальной жидкости, или сенсибилизированые антиэритроцитарными антителами), при болезнях щитовидной железы, лекарственной аллергии и туберкулезе. Прямой тест розеткообразования был описан при Rh-сенсибилизации (D-эритроциты), аутосенсибилизации, вызванной тромбоцитами, при гистонесовместимости (тромбоциты как носители EL-антигенов), а также при бактериальной сенсибилизации (адгезия).
Иммунный ответ стимулированных лимфоцитов. Общеизвестен факт, что антигенная стимуляция приводит к изменению метаболизма, синтеза белка сенсибилизированных клеток. Основными показателями этих процессов служат активация синтеза ядерной ДНК и РНК, а также продукция медиаторов.
1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов in vitro (РБТЛ). Исследуемую суспензию лимфоцитов больных (или экспериментальных животных) культивируют в присутствии соответствующего антигена (или митогена). Под воздействием антигена (или митогена) происходит стимуляция лимфоцитов, их трансформация в бласты, что можно оценить морфологически или с помощью изотопной метки. В РБТЛ используют лимфоциты периферической крови, лимфатических узлов или селезенки. Особое значение уделяют условиям культивирования (состав культуральной среды, рН, температура).
Для морфологической оценки наиболее оптимальна окраска Паппенгейма. Критериями трансформации лимфоцитов являются увеличение диаметра клетки и размеров ядра, многочисленные ядрышки, базофилия цитоплазмы с просветленным перинуклеарным пространством. Определенную сложность представляет дифференцирование бластных форм от макрофагов: с этой целью в клеточную суспензию добавляют частицы полистирена, которые фагоцитируются только макрофагами. Для определения процента бластов подсчитывают в общей сложности 500-1000 клеток. Кроме того, для оценки РБТЛ используют изотопную метку; в культуру лимфоцитов добавляют тимидин, меченный 3Н и 14С (синтез ДНК), цитидин или уриДин, меченные 3Н (синтез РНК), лейцин, меченный 14С (синтез белка). Клетки тщательно отмывают. После этого с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика определяют активность реакции по включению изотопа в синтез ДНК, РНК и белка. Результаты можно учитывать и с помощью цитофлюорографии: с этой целью в культуру лимфоцитов добавляют флюорохром (например, этидиумбромид), который служит индикатором процессов обмена, происходящих в ядре.
При высокой степени сенсибилизации включение изотопа повышается в 102-103 раз. Следует учесть, что используемый антиген может оказывать токсическое или неспецифическое стимулирующее действие, поэтому необходимы соответствующие способы контроля. В этом качестве служат культуры лимфоцитов: а — больных без добавления антигена (или с внесением сходного); б — здоровых лиц с добавлением антигена. Степень спонтанной трансформации, лимфоцитов составляет около 1%.
Области практического применения РБТЛ:
— доказательство клеточной сенсибилизации. РБТЛ — довольно чувствительный метод. Положительный результат может быть получен при сенсибилизации доноров низкой дозой (0,001 мкг) туберкулина или дифтерийного токсоида. Высокий уровень стимуляции лимфоцитов был выявлен при бактериальных, вирусных, грибковых, протозойных и других видах гетерологичной сенсибилизации (белки животного происхождения, конъюгаты гаптен-белок, лекарственные препараты, пищевые продукты, пыльца), а также при аутосенсибилизации (ревматоидный артрит, гепатит, тиреоидит);
— тестирование на гистосовместимость (смешанные культуры лимфоцитов);
— оценка функциональной активности лимфоцитов. В данном случае РБТЛ ставят с митогеном ФГА (неспецифическая стимуляция).
К недостаткам метода следует отнести значительную продолжительность реакции. Все попытки сократить время культивирования не привели к воспроизводимым результатам.
2. Продукция лимфокинов. В первую очередь это относится к факторам, ингибирующим миграцию макрофагов и лейкоцитов.
Реакция торможения миграции макрофагов (РТММ). Известно, что выделение макрофагов у человека представляет определенную сложность, поэтому данный метод ограничен экспериментальной моделью. Применение РТММ в клинике стало возможным, когда было показано, что лимфоциты человека в присутствии антигена синтезируют МИФ морской свинки. Капиллярный метод, предложенный George и Vaughan, получил признание и широкое распространение.
Для выделения макрофагов морской свинке внутрибрюшинно вводят парафиновое масло или гликоген. В образовавшемся экссудате около 60% макрофагов, остальное содержимое лимфо- и гранулоциты. Предварительно отмытыми клетками заполняют капилляры (при непрямом варианте метода они служат только в качестве индикаторов). Капилляры помещают в среду для культивирования, содержащую смесь: лимфоциты + антиген. Подготовленные таким образом специальные платы с ячейками инкубируют при 37 °С в течение 24-48 ч. Часть макрофагов диффузно мигрирует из капилляра: результаты оценивают по площади этой миграции. Признаком торможения реакции служит уменьшение площади миграции макрофагов относительно контроля. Одной из модификаций является способ, при котором макрофаги мигрируют из капли агарозы.
Относительно новые данные свидетельствуют о возможности продукции МИФ стимулированными В-лимфоцитами, поэтому интерпретация положительных результатов в плане клеточно-опосредованной сенсибилизации довольно проблематична.
РТММ была использована для выявления иммунного ответа к возбудителям инфекций, для доказательства аутосенсибилизации, а также для определения степени гистосовместимости.
Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) представляет собой модификацию РТММ. В ней применяют лейкоциты периферической крови. Капилляр заполняют предварительно отмытой суспензией лейкоцитов и аналогично прямому тесту РТММ помещают в культуральную среду, содержащую антиген. В течение 24-часовой инкубации при 37 °С лейкоциты мигрируют из капилляра примерно на 6-10 мм. Преимуществом теста является сокращение времени инкубации до 24 ч. Воспроизводимость реакции ниже, чем у непрямого варианта РТММ. Наиболее оптимальный вариант для рутинной техники- реакция миграции лейкоцитов в агарозе. Феномен торможения миграции лейкоцитов опосредован ФУЛ, который вырабатывается, по-видимому, Т- и В-клетками. Этот метод был успешно использован при бактериальных инфекциях, ауто- и контактной сенсибилизации, лекарственной аллергии, реакциях трансплантационного иммунитета и опухолевых процессах.
Тест оценки электрофорегической подвижности макрофагов. В данном случае индикатором продукции лимфокинов служит подвижность макрофагов в электрическом поле. Преимущества теста: усовершенствованный способ количественной оценки результатов, высокая воспроизводимость; недостаток — необходимость дорогостоящей технической аппаратуры. За кинетику макрофагов ответствен MSF.
Оценка действия иммунокомпетентных клеток на антигенсодержащие клетки. Значение этого исследования состоит в том, что с помощью тест-системы можно доказать предполагаемую роль патогенетических механизмов клеточного иммунитета. Применение цитотоксического теста ограничено теми ситуациями, когда антиген — составная часть жизнеспособной культивируемой клетки. Цитотоксический эффект реализуется при добавлении сенсибилизированных лимфоцитов в культуру клеток, содержащих антиген. Реакцию оценивают путем подсчета погибших клеток (суправитальное окрашивание) или по степени включения изотопа в синтез белка (аминокислоты или ДНК клеточных ядер, меченные 14Q). Убедительны те положительные результаты, при которых лимфоидные клетки не содержали примеси сыворотки, так как В-лимфоциты, сенсибилизированные антителами, могут указывать цитотоксическое действие.