Напряженность иммунитета в ветеринарии
Введение
За период своей практики я встречал случаи заболевания вакцинированных животных. Причин болезни вакцинированных животных множество. К ним относят: неправильная схема вакцинации животного, некачественные вакцины, отсутствие или слабая реакция иммунитета на вакцину и т.д. На последнем хотелось бы остановиться более подробно. В первом случае могли поставить щенку вакцину однократно, и ее погасил материнский иммунитет, и как следствие животное заболело, встретившись с возбудителем болезни. Но в том случае, когда соблюдена схема вакцинации, а собака заболела парвовирозом, — возникает вопрос : «Почему?», который задают мне владельцы заболевшего питомца. Как на этот вопрос я отвечу, разберем ниже.
Глава 1 Иммунитет.
Начнем с теории и зададим такой вопрос: что такое иммунитет? Иммунитет – это способность иммунной системы избавлять организм от чужеродных белков. Вирусы, бактерии и прочие микроорганизмы состоят из белков. Попав в организм животного иммунные клетки (Т-лимфоциты), определяют, что организм атакован чужеродными белками и подает сигнал В-лимфоцитам на синтез антител. Антитела – это вещества, которые выделяются В-лимфоцитами, и они способны связывать чужеродные белки. Их называют в данном случае антигенами. Антитело, соприкасаясь с микробом — его обездвиживает, затем подключается лимфоцит, который находит этот клубок и пожирает его, тем самым убивает микроб собственными ферментами. Все просто, но есть проблема: для организма антитела специфичны к определенному антигену, и на каждого нового возбудителя необходимо иммунитету вырабатывать новый вид антител. То есть антитела против вируса чумы плотоядных не могут убить вирус инфекционного гепатита собак. Зато для лаборатории это на руку. Мы теперь знаем, что в организме есть определенное вещество – антитело, которое специфично для подавления определенного микроба. Теперь осталось выявить это вещество в лаборатории и ответить на поставленный вопрос: есть ли иммунитет у моего питомца?
Глава 2 Обнаружение антител в организме животного.
Есть различные способы для определения антител, но суть их заключается в одном: когда соприкасается антитело и антиген происходит химическая реакция, а признак любой химической реакции — изменение цвета, выпадение в осадок и другие визуальные признаки. В нашей лаборатории при клинике есть специальные тест-системы ImmunoComb, достоинство которой заключается в дешевизне в отличие от других методов определения антител, простота использования и точность. Этим тестом можно определить не только наличие иммунитета на инфекции, но и интерпретировав результаты, можно подтвердить заражение животного, так как организм реагирует на возбудителя, выплескивая большое количество антител в кровь, которые мы определяем количественно этой тест системой.
Глава 3 Тест-система ImmunoComb : как она выглядит и как ей пользоваться. Инструкция.
Тест ImmunoComb® является модифицированным иммуноферментным анализом с использованием вторичных антител меченных ферментом, при котором определяется уровень антител к вирусам и бактериям в сыворотке или цельной крови животных и птиц, который выполняется без дополнительного оборудования.
Каждый набор содержит все необходимые реагенты для выполнения 12 индивидуальных анализов:
1) Пластиковый Гребень с 12 зубцами, на который нанесены антигены и внутренний контроль.
2) Проявочную ванну, заполненную производителем всеми необходимыми реагентами.
3) 12 капилляров и поршень для взятия образца.
4) Одноразовый пинцет
5) Цветную шкалу CombScale для количественного считывания результата анализа.
Анализ проводится при температуре 20-25°C.
Пинцетом вскрывается алюминиевая фольга с необходимого для анализа количества ячеек ряда А и вносится 5мкл сыворотки или 10 мкл цельной крови. Для индивидуального или группового исследования отламывается необходимое количество зубцов Гребня и вставляется в ячейки ряда А с образцом и переносится в оставшиеся ячейки через определенный интервал времени в соответствии с инструкцией. Специфичные IgG антитела из образца, при их наличии, связываются с антигеном на точке зубца Гребня и окрашиваются ферментативной реакцией. Результаты проявляются в виде окрашенных точек на зубце Гребня через 40 минут. Интенсивность цвета точек результата соответствует уровню антител в тестируемом образце. Результаты количественно оцениваются с использованием точки Положительного контроля и калибровочной шкалы CombScale.
Внимание! Важно проконтролировать следующие шаги для обеспечения правильной проявки теста:
1) Перед тем как проводить анализ, поместите набор в теплую комнату на 1-2 часа или в термостат/инкубатор при температуре 37°C на 20 минут. Растворы в наборе должны достичь температуры 20-25°C.
2) Во время инкубации Гребня в рядах А, С и F обязательно подвигайте гребень вверх-вниз несколько раз, в начале инкубации и снова каждые 2-3 минуты в течение инкубации.
Заключение.
На примере можно увидеть результаты провидения теста. На фото 2 видны точки на полосках. Верхняя является контрольной, вторая — показывает наличие антител к гепатиту инфекционному, третья – к парвовирозу, и последняя — наличие антител к чуме плотоядных. Слева — полоска исследования сыворотки крови здоровой собаки, дважды вакцинированной с интервалом в один месяц, последнюю вакцину ввели три дня назад. Справа — полоска показывает исследование биологического препарата «Гискана». Как видно положительной реакции на этот препарат нет, хотя она должна быть. Препарат «Гискан» мы не применяем в нашей клинике по причине его клинической не эффективности, лабораторно показано, что антител там нет.
Ответ на вопрос почему вакцинированное животное заболело: может быть отсутствие или малое количество сформированных антител в организме на введенную вакцину, наличие которых можно проверить тест-системой ImmunoComb.
Вет. Клиника «Ай-болит» г. Улан-Удэ
в/в Мостыгин А.Е.
.png)
.png)
.png)
Иммунитет (от лат. immunitas — освобождение или избавление от чего-либо) — состояние невосприимчивости организма к воздействию патогенных микробов, их токсинов и других чужеродных веществ биологической природы. Организмы человека и животных весьма точно дифференцируют «свое» и «чужое», благодаря чему обеспечивается защита не только от внедрения патогенных микробов, но и чужеродных белков, липополисахаридов, полисахаридов и других чужеродных веществ. Следовательно, главное значение иммунитета состоит в распознавании «своего» и «чужого», что жизненно важно. Поступление во внутреннюю среду организма веществ с признаками чужеродной информации (макромолекул белков, полисахаридов и др.) грозит нарушением структурного и химического состава этого организма. Количественное и качественное «постоянство» внутренней среды, называемое гомеостазом, обеспечивается процессами саморегулирования во всех живых системах. Иммунитет — одно из проявлений гомеостаза. В этой связи иммунитет является свойством всего живого: человека, животных, растений и даже бактерий.
Система органов и клеток, осуществляющая реагирование против чужеродных субстанций, получила название иммунной системы организма. Она распределена по всему организму, ее клетки постоянно рециркулируют по всему телу через кровоток, она обладает способностью вырабатывать сугубо специфические молекулы антител, различные по своей специфике в отношении каждого антигена.
По происхождению различают два вида иммунитета: врожденный и приобретенный.
Врожденный иммунитет
Врожденный (видовой, наследственный, генетический) иммунитет — это невосприимчивость к инфекционным агентам, детерминированная в геноме и проявляемая количеством и порядком расположения ганглиозидов определенного типа на поверхности мембран клеток. Этот вид иммунитета свойственен животным определенного вида к определенному возбудителю инфекции и передается из поколения в поколение. Например, лошади не болеют ящуром, крупный рогатый скот — сапом, собаки — чумой свиней, животные — сифилисом и т. д. В основе механизмов врожденного иммунитета к определенным возбудителям лежат отсутствие в клетках организма рецепторов и субстратов, необходимых для адгезии и размножения возбудителя, наличие веществ, блокирующих размножение патогенных микробов. Последние не могут размножаться в организме, и заболевание не возникает. Например, Brucclla abortus будет размножаться в плаценте только тех видов животных, которые содержат углевод эритритол.
Врожденный иммунитет весьма прочный, но не абсолютный. Так, в естественных условиях куры не болеют сибирской язвой, однако Пастер заразил курицу сибиреязвенной бациллой после искусственного понижения температуры тела погружением ее конечностей в холодную воду. Мечникову удалось вызвать экспериментальный столбняк у лягушки (весьма устойчивой к столбнячному токсину) путем согревания ее в термостате. Врожденной резистентностью в основном обладают взрослые животные. У новорожденных во многих случаях видовая устойчивость отсутствуют. Например, кролики-сосуны и мышата чувствительны к заражению вирусом ящура. Весьма чувствительны к заражению вирусами и бактериями развивающиеся куриные эмбрионы, что в практике используют для получения вакцин.
Следует учитывать, что животные, не заболевая определенной инфекционной болезнью, могут быть носителем возбудителя и представлять опасность для других видов. Например, человек может быть носителем вируса чумы собак.
Важно отметить, что естественная невосприимчивость является не только видовым признаком, среди восприимчивых к определенным микробам видов существуют породы, популяции и линии, животных, отличающиеся высокой устойчивостью к данному возбудителю. Так, при высокой чувствительности овец к сибирской язве алжирские овцы отличаются высокой к ней устойчивостью. Свиньи йоркширской породы по сравнению с другими породами устойчивее к роже свиней. Куры породы белый леггорн более устойчивы к пуллорозу, чем птицы пород красный род-айленд и плимутрок.
Приобретенный иммунитет
Характерная особенность приобретенного иммунитета — его специфичность, т. е. устойчивость организма только к определенному возбудителю болезни. Приобретенный иммунитет подразделяют на естественный и искусственный. Естественно приобретенный иммунитет, в свою очередь, делят на активный и пассивный. Активный (постинфекционный) образуется после естественного переболевания животного. Естественно приобретенный иммунитет не обязательно должен быть связан с клинически выраженным переболеванием. Во многих случаях в организм животного систематически попадают дозы возбудителя меньше той, которая может вызвать заболевание. В этом случае происходит скрытая иммунизация, которая у животных, достигших определенного возраста, создает активный иммунитет к определенному возбудителю. Такое явление называют иммунизирующей субинфекцией.
Естественно приобретенный пассивный иммунитет — иммунитет новорожденных, приобретенный ими за счет поступления плоду от матери антител через плаценту (трансплацентарный) либо уже после рождения через кишечник с молозивом (колостральньш, или молозивный). У птиц (например, кур) материнские антитела передаются с лецитиновой фракцией желтка (трансовариальный). Важно отметить, что насыщение кровотока иммунными фракциями новорожденных жвачных, лошадей, свиней происходит в основном колостральным путем. В этой связи различают естественно и искусственно вызванный колостральный иммунитет. В первом случае иммунитет обусловлен антителами, естественно выработанными в организме матери под воздействием различных антигенов окружающей среды. Во втором случае путем направленной иммунизации организма матери определенными антигенами вырабатываются специфические антитела против определенного возбудителя болезни.
Молозиво неиммунизированных коров обладает бактериостатическими и антитоксическими свойствами в отношении многих патогенных микроорганизмов — кишечной палочки, сальмонелл, стафилококков и др. Так, в молозиве в среднем при первой дойке содержится в 100 мл Ig — 900 мг, IgG — 200, IgM — 400, IgA — 300 мг, а в том же количестве молока уже соответственно 50, 2, 5 и 8 мг. Воспринятые с молозивом иммуноглобулины (антитела) в кишечнике, например новорожденных телят, абсорбируются и неизмененными проходят через стенку кишечника в лимфатическую систему, а затем в кровеносное русло. Следует знать, что у домашних животных кишечник проницаем для молозивных антител лишь первые 24—36 ч, поэтому молозиво новорожденный должен получить как можно раньше с момента рождения.
Естественно приобретенный активный иммунитет может сохраняться 1—2 года, но в некоторых случаях — пожизненно (например, у собак, переболевших чумой, у овец, переболевших оспой). Естественно приобретенный пассивный иммунитет обеспечивает состояние невосприимчивости от нескольких недель до нескольких месяцев.
Искусственно приобретенный иммунитет также подразделяют на активный и пассивный. Активный (поствакцинальный) возникает в результате иммунизации животных вакцинами. Вакцинный иммунитет развивается через 7—14 дней и сохраняется от нескольких месяцев до одного года и более. Пассивный иммунитет создается при введении в организм иммунной сыворотки, содержащей специфические антитела против определенного возбудителя болезни. Пассивный иммунитет можно создать и при введении сывороток крови животных-реконвалесцентов (переболевших данной болезнью), например при ящуре. Пассивный иммунитет, как правило, не превышает 15 дней.
Иммунитет также принято классифицировать по направленности действия защитных механизмов организма на микроорганизмы или их продукты. Различают антибактериальный иммунитет, когда защитные механизмы направлены против патогенного микроба, в результате предотвращается размножение и распространение в нем микроба.
Противовирусный иммунитет обусловливается выработкой организмом противовирусных антител и механизмами клеточной защиты.
Антитоксический иммунитет, при образовании которого бактерии не разрушаются, но вырабатываются антитела, эффективно нейтрализующие токсины в организме больного животного.
Иммунитет при протозойных и гсльминтозных заболеваниях направлен на обезвреживание и уничтожение возбудителей болезней.
Различают также местный (локальный) иммунитет. Понятие «местный иммунитет» впервые было введено А. М. Бередка в 1925 г. Логическим выводом теории местного иммунитета явилось изыскание методов локальной иммунизации тканей и органов, являющихся воротами инфекции — первого защитного барьера против инфекционного агента. В этой связи стали широко в практике применять аэрогенный и пероральный способы иммунизации.
Если после перенесенной болезни организм освобождается от возбудителя, сохраняя при этом состояние невосприимчивости, то такой иммунитет называют стерильным. Однако при многих инфекциях иммунитет сохраняется только до тех пор, пока в организме находится возбудитель болезни. В этом случае говорят об инфекционном или нестерильном иммунитете (премуниция).
В зависимости от механизмов зашиты организма различают также гуморальный и клеточный иммунитет. Гуморальный иммунитет обусловливается выработкой в зараженном организме специфических антител, клеточный иммунитет — за счет образования специфически реагирующих с возбудителем (антигеном) Т-лимфоцитов.
Донник Ирина Михайловна Директор ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института (УрНИВИ). Член-корреспондент РАСХН, профессор
Шилова Евгения Николаевна Зав. отделом инфекционной патологии ГНУ УрНИВИ Кандидат ветеринарных наук, доцент
В последние годы большое внимание уделяется профилактике высокопатогенного гриппа птиц, как инфекции, представляющей возможную угрозу человечеству. Одним из наиболее эффективных средств профилактики гриппа А птиц является иммунопрофилактика. Вакцинация, не препятствуя инфицированию птицы, защищает ее от клинического проявления заболевания, увеличивая порог вирусной инфекции, необходимый для инфицирования привитой птицы, а также воздействует на эпизоотический процесс, ограничивая пути передачи и распространение инфекции (Ямникова С.С, Смоленский В.И., Хохлачев О.Ф. и др., 2007).
Как известно, эффективность применения вакцины оценивают по трём показателям: уровню поствакцинального иммунитета, выраженного в установлении протективных титров антител, заболеваемости и смертности птиц при экспериментальном или полевом инфицировании. Согласно «Инструкции по применению вакцины против гриппа птиц инактивированной эмульгированной» (2006), данная вакцина должна вызывать не менее чем у 80 % вакцинированных птиц накопление в крови антител к вирусу гриппа птиц в титре 1/16 со штаммом вируса, имеющего иную антигенную форму, иммунитет формируется в течение 28 дней после вакцинации.
Установлено, что интенсивность иммунного ответа у животных и птиц может отличаться на разных территориях, в случае, если на организмы влияют разные факторы внешней среды, в т.ч. и неблагоприятная экологическая обстановка (Бектимиров Т.А., Горбунов М.А., Никитюк Н.М. и др., 2001).
В связи с этим, нами проведены исследования напряженности и длительности иммунитета при вакцинации взрослых гусей против гриппа птиц А.
Нами проведена экспериментальная вакцинация разных видов домашней птицы против гриппа птиц А. Птицу содержали в опытных вольерах вивария. Рацион был стандартным на основе комбикорма. Ведение препарата организовывали в отдельном помещении, вынесенном за пределы птицепредприятий.
Вакцинацию гусей проводили разработанной в ФГУ ВНИИЗЖ инактивированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц из шт. H5N1 (производство ОАО «Покровский комбинат биопрепаратов»). Вакцину вводили согласно наставлению: подкожно, в дозе 0,5 мл. на голову. Вакцинацию проводили трехкратно, с интервалом в 1 мес.
Для получения сыворотки кровь у гусей брали из яремной вены каждые 10 дней после вакцинации.
Уровень поствакцинальных антител в сыворотке эксперементальной птицы определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием стандартного диагностического набора.
Дополнительно у опытной и контрольной птицы определяли гематологические и иммунологические показатели. В цельной крови выявляли содержание гемоглобина (гемометром Сали), количество эритроцитов и лейкоцитов [И.А. Болотников, Ю.В. Соловьев, 1980]. Подсчет эритроцитов и лейкоцитов осуществляли одновременно в камере Горяева по методике Фриед и Лукачевой в модификации Болотникова И.А Для характеристики клеточного и гуморального иммунитета (проводили количественное определение Т- и В- лимфоцитов [Л.С. Колабская, 1980].
Исследования проводились в течение 2005-2007 г.
Результаты исследования:
После проведенной вакцинации установлено, что уже через 10 дней во всех пробах сыворотки крови птиц выявляются антитела в протективных титрах. При этом разброс разведений, в которых обнаружены антитела, составляет от минимального — 1/16 до максимального — 1/256 (у 25 % птиц титры составили 1/16, у 8,3% — 1/32, у 16,6% — 1/64, у 16,6% — 1/128, у 33,3% — 1/256).
Однако уже через 30 дней после введения вакцины у гусей отмечено снижение титров антител, при этом у 33% гусей выявлены антитела ниже протективного титра (разведение 1/8). Таким образом, однократное введение вакцины не вызывало полноценную иммунную защиту у 67% птицы через 30 дней после первичной вакцинации.
Первую ревакцинацию птицепоголовья провели через 30 дней (третья декада). Анализ показал, что через 10 дней после ревакцинации было отмечено значительное снижение напряженности иммунитета у гусей. При этом у 33% птиц антитела совсем не выявляли, у 17%титр был ниже протективного (1/8), у 50 % в титре 1/16 — 1/32. То есть, повторное введение вакцины через 30 дней после предыдущей вакцинации (четвертая — пятая декада) искусственно снижает напряженность иммунитета вплоть до исчезновения антител, и птица в этот период становилась не иммунной к возбудителю гриппа птиц.
Через 14-21 день после ревакцинации (шестая декада) отмечали рост титра антител, при этом все 100% вакцинированных птиц имели специфические гемагглютинины в протективных концентрациях (1/16-1/128). Таким образом, после рекомендуемой наставлением однократной ревакцинации у птиц есть резистентность к данным заболеваниям.
После второй ревакцинации (седьмая декада) снижение концентрации антител не происходило, напротив, были отмечены максимальные титры (1/64-1/128), которые удерживались в течение месяца (70-100-й день опыта).
Начиная со 110-го дня опыта (одиннадцатая — двенадцатая декада), отмечено снижение концентрации антител к вакцин¬ному антигену . Также установлено, что в экспериментальной группе вакцинированных против ГП птиц ежемесячно отмечалось наличие, в среднем, 30-40% птиц, не имеющих иммунной защиты к вакцинному антигену, а, следовательно, к возбудителю гриппа птиц А. У остальных птиц концентрация специфических гемагглютининов оставалась низкая, но достаточная для защиты от заболевания (1/16-1/64).
К концу периода наблюдения (через 12 мес. после начала вакцинации) протективные титры сохранялись у 50% поголовья, средняя концентрация антител составила 1/42.
Обобщая полученные данные, можно отметить, что, в це¬лом, всех птиц данной популяции можно было условно разделить на три группы: с высоким уровнем антителообразования, со средним и с низким. При этом, если у птиц после первой вакцинации отмечались высокие титры антител, то и на протяжении всего периода наблюдения они продолжали оставаться высокими (1/128-1/512). Количество таких птиц в экспериментальной популяции было, в среднем, 15% .
У гусей, которые после первой вакцинации показывали низкие значения напряженности иммунитета, после 1 и 2 ре¬вакцинации уровень антител продолжал оставаться низким и, спустя 4-5 мес. после начала опыта, исчезал совсем. Данная группа птиц более половины срока наблюдения оставалась неиммунной после трехкратной вакцинации, их количество составляло, в среднем, 37%. Поголовье птицы, которое показывало средние уровни антителообразования (1/16-1/64), составляло, в среднем, 48%.
При проведении биохимических и гематоиммунологических исследований установлено, что у гусей перед вакцинацией отмечено низкое содержание у-глобулинов, средние значения данного показателя составили 17,6% от среднего содержания (при норме 35-37%). Также у гусей отмечено достаточно низкое содержание тимоцитов и В-клеток (34% и 21 % соответственно), изменение их соотношения (Т/В составило 2,1 у.е.), что свидетельствует об иммунологической недостаточности.
Проведенные исследования показали, что полноценный иммунный ответ на введение вакцины отмечен только после трехкратного введения вакцины с интервалом 30 дней, концентрация защитных антител у птиц удерживалась при этом до 12 мес. в протективных титрах. также необходимо отметить, что в популяции, в среднем, до 40% птиц не формируют иммунитет против ГП.
Заключение: Таким образом, исследованиями установлено, что при вакцинации гусей трехкратно с интервалом 1 мес, в среднем, 37-50% поголовья показывают низкий иммунный ответ на введение вакцины, что выражается отсутствием антител либо уровнем антител ниже протективного уровня (1/8). Данные исследования являются предварительными, поскольку проведены на ограниченном поголовье экспериментальной птицы и требуют дальнейших производственных опытов.