Нарушения иммунитета при критических состояниях особенности диагностики

В начале XXI столетия сепсис по-прежнему остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальности. Сепсис входит в десятку ведущих причин смерти в цивилизованном мире. В структуре всех разновидностей сепсиса доминирует хирургический сепсис (ХС) [18–22].

С 2004 года во всем мире широко обсуждается новая парадигма, уточняющая приоритеты в патогенезе и интенсивной терапии (ИТ) сепсиса, базирующаяся на теориях микроциркуляторно-митохондриального дистресс-синдрома и DAMP — Dangerassociated molecular patterns [7, 20, 21]. Патофизиологические механизмы развития сепсиса в значительной степени являются результатом ответа врожденного иммунитета пациента под влиянием генетических факторов. Решающую роль в этом сложном каскаде событий играют нейтрофилы (Нф). Микробы и их токсины (pathogen-associated molecular patterns) распознаются нейтрофилами посредством толл-подобных рецепторов, подвергаются деструкции, поглощаются, перевариваются мигрирующими в очаг инфекции Нф и моноцитами. Происходит избыточная метаболическая активация Нф — респираторный взрыв с гиперпродукцией митохондриями Нф микробицидных активных форм кислорода (АФК) — синглетного кислорода 1O2, гипохлорита ClO–, перекиси водорода H2O2 и азота, которые повреждают не только микробы, но и митохондрии эндотелиоцитов. Активация других Нф, моноцитов, эндотелиоцитов провоцирует «цитокиновую бурю», активацию комплемента, вызывает митохондриальную дисфункцию, неуправляемый воспалительно-коагуляционный каскад с критическим нарушением микроциркуляции, повреждением тканей и развитием синдрома полиорганных нарушений (СПОН). Гиперпродукция Нф лизосомальных ферментов вызывает деструкцию не только микробов, но и клеток тканей хозяина, которые необратимо гибнут путем некроза. В условиях лавинообразно нарастающей интоксикации и митохондриального дистресса активируется апоптоз — заложенная природой в каждой клетке млекопитающих программа самоуничтожения, обратимый до определенного момента процесс, позволяющий биологически целесообразно контролировать количество и качество клеток различных тканей — нейтрофилов, лимфо-, эндотелио-, гепато-, энтеро-, миокардиоцитов и т.д., даже безъядерных эритроцитов [14]. Изучение процессов апоптоза при сепсисе позволит оптимизировать диагностическую и лечебную тактику [1–8, 10–14, 16, 17, 20–26].

Цель работы — изучить патогенетическое значение апоптоза циркулирующих нейтрофилов при хирургическом сепсисе и возможность использования суправитального определения уровня апоптоза циркулирующих нейтрофилов как диагностического и прогностического критерия тяжести течения ХС.

Материал и методы

Проведено нерандомизированное ретроспективное когортное аналитическое обсервационное клиническое исследование 35 пациентов (возраст — 18–76 лет, женщин — 17, мужчин — 18), находившихся на лечении в хирургических отделениях № 2 и 3 и реанимационном отделении Донецкого областного клинического территориального медицинского объединения с января 2003 по декабрь 2004 по поводу хирургического сепсиса вследствие перитонита (12), гнойников брюшной полости (6), забрюшинной флегмоны (4), гнилостного парапроктита (3), флегмоны мягких тканей (4), диабетической флегмоны/гангрены нижних конечностей (4), инфекции мочевых путей (2) с развитием органных дисфункций у всех, а септического шока — у 17 из 35 пациентов. Диагностика сепсиса — по рекомендациям

CCM/ESICM/ACCP/ATC/SIS ISDC [15]. Прогнозирование исхода проводили по шкале APACHE II, динамику органной дисфункции — по SOFA. После хирургической санации очага инфекции проводили антибактериальную, инфузионно-трансфузионную терапию, респираторную, инотропную, нутритивную, эфферентную, иммунотропную поддержку — комплекс ИТ до внедрения в практику принципов экстренной целенаправленной органопротективной терапии — модифицированного протокола MUST [2, 3, 22]. На этапах лечения проводили мониторинг витальных функций, исследование клинических, биохимических, иммунологических показателей, микробиологический контроль гемокультур, отделяемого дренажей. Вычисляли интегральные гематологические индексы, определяли относительное количество лимфоцитов (Лфц) в венозной крови, в т.ч. Лфц, экспрессирующих CD95 — рецепторы индукции апоптоза, CD25 — рецепторы к интерлейкину-2 (IL-2), уровень в крови метаболитов оксида азота (mNO), цитокинов — TNF-α и хемокина IL-8, хемилюминесценции лейкоцитов (ХЛ) — маркера респираторного взрыва лейкоцитов —концентрации АФК, уровень в крови продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) — диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), состояние антиоксидантной системы (АОС) — по концентрации в крови альфа-токоферола, активности каталазы (Кат), супероксиддисмутазы (СОД) с вычислением коэффициента ПОЛ/АОС.

Определение коммитированных к апоптозу (Апо) и некротически измененных Нф производили путем световой микроскопии в тонких мазках венозной крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе после предварительного кондиционирования венозной крови по методике, разработанной А.В. Седых [1, 4, 6]. На увеличении × 1000 просматривали тысячу клеток и учитывали (в ‰) измененные Нф, которые дифференцировали по характерным морфологическим признакам: апоптозные — по уменьшению размеров, по конденсированной цитоплазме, по уплотненному бесструктурному хроматину, часто разделенному на несколько округлых телец (рис. 1); некротические — по разрыву цитоплазматической и внутриклеточных мембран, по разрушению органелл, по выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство [1, 4, 6]. Исследование проводили в первые сутки после установления диагноза «сепсис», но не ранее 24 ч после хирургического устранения очага. Вычисляли отношение некротически измененных циркулирующих Нф к апоптозным.

Выполнены патоморфологические исследования внутренних органов 8 умерших пациентов.

Статистическая обработка проводилась при помощи программных пакетов MedStat (v. 4), Microsoft Excel, SPSS for Windows (v. 13). Применяли тест Шапиро — Уилка, t-критерий Стьюдента, W- и Т-критерии Вилкоксона, критерий χ2, множественные сравнения с использованием критериев Шефе, Даннета, Данна и рангового однофакторного анализа Крускала — Уоллиса, корреляционный анализ с использованием непараметрических коэффициентов — парной (Кендалла) и ранговой (Спирмена) корреляции. Группа здоровых — доноры-добровольцы. В сравниваемых группах оценивали шансы и риски летального исхода.

Результаты и обсуждение

Ретроспективно 35 пациентов были вначале разделены на 3 группы/когорты в зависимости от выраженности апоптоза нейтрофилов венозной крови (табл. 1, рис. 2).

Так, у 16 пациентов (группа А) этот показатель был в 2,8 раза (p < 0,01) снижен, у 9 (группа В) — в 1,2 раза (р < 0,05) снижен и у 10 (группа С) — в 1,5 раза (p < 0,05) повышен в сравнении со здоровыми (группа D). При вычислении соотношения некротически измененных Нф к апоптотическим выявлено, что в группе А этот показатель превышал показатель группы D (норма) в 4,1 раза (p < 0,01), группы В — в 3,9 раза (p < 0,05) и группы С — в 4,1 раза (p < 0,01). Недостоверными (p > 0,05) оказались различия по этому показателю в группах D, В и С (рис. 2B). При анализе течения ХС выяснено, что в группах В и С органная дисфункция не трансформировалась в развернутый СПОН, что позволило объединить пациентов этих групп в одну группу/когорту В + С (табл. 1).

Корреляционный анализ выявил достоверно высокую и среднюю степень связи между степенью тяжести состояния пациентов с такими показателями, как отношение некротически измененных к апоптотическим Нф, АпоНф, способность лейкоцитов к спонтанной миграции в очаг инфекции, антиоксидантная активность сыворотки и плазмы, а также с интегральными гематологическими индексами: индексом системной внутрисосудистой альтерации (ИСВА), индексом Нф/Лфц, ядерным индексом сдвига Нф, реактивным ответом Нф и гематологическим показателем интоксикации (табл. 2).

Уже в первые сутки после постановки диагноза ХС в группе А отмечено повышение уровней в венозной крови mNO, TNF-α, IL-8; ХЛ в сравнении как со здоровыми (p < 0,01), так и с группами В и С (рис. 2C–F), что свидетельствовало о более высоком уровне провоспалительных цитокинов, АФК и азота у пациентов с низким Апо Нф. ИСВА в группе А был достоверно выше как в сравнении со здоровыми, так и с группами В и С (рис. 3A), что указывало на более выраженную степень эндотелиальной дисфункции у пациентов с низким Апо Нф. Суррогатный маркер митохондриальной дисфункции ПОЛ/АОС был также выше у пациентов с низким Апо Нф (рис. 3B). Достоверно более выраженными были относительные лимфопения и нейтрофилез у пациентов с низким Апо Нф (рис. 3C–D). Повышение в сравнении со здоровыми концентрации циркулирующих Лфц-CD95 и понижение концентрации циркулирующих Лфц-CD25 отмечено во всех группах (А, В, С), но более выраженное — у пациентов с низким Апо Нф (рис. 3E–F), что свидетельствовало об иммунном дистрессе при ХС — повышении уровня апоптоза Лфц и снижении чувствительности Лфц к воздействиям цитокина IL-2, регулирующего ответ иммунной системы на антиген. По данным C. Oberholzer с соавт. (2001), апоптоз Лфц при сепсисе могут индуцировать как отсутствие в циркуляции IL-2, так и гиперпродукция TNF-α.

Проведен клинико-морфологический анализ танатогенеза 8 пациентов. В сосудах микроциркуляции у 6 умерших наблюдались набухание, десквамация и очаговая пролиферация эндотелиоцитов. У 5 — нарушения гемомикроциркуляции в виде стазов, сладжей эритроцитов, фибринных тромбов, лейкостазов. Наиболее часто эти изменения определялись в сосудах мозга, легких, реже — миокарда, печени, почек (рис. 4A–F).

Легкие, как единственный орган, получающий 100 % сердечного выброса (венозной крови, оттекающей из очагов инфекции), были первой мишенью в «каскаде» ПОН при ХС. Морфологическим эквивалентом клиники сепсис-индуцированного острого легочного повреждения были гистологические изменения в легких: полнокровие, отек, очаги эмфиземы и дисателектазов. В ряде случаев — мелкоочаговые кровоизлияния, сегментоядерная инфильтрация, пневмонические фокусы, утолщение и инфильтрация межальвеолярных перегородок нейтрофилами и макрофагами (рис. 4C).

Ведущим клиническим признаком у всех пациентов с ХС был инфекционно-воспалительный эндотоксикоз (ЭТ). Массивность токсической микробной нагрузки при абдоминальном ХС проявлялась развитием дисфункции печени и почек. Морфологическим эквивалентом эндотоксикоза, манифестирующего ПОН, были гистологические изменения органов детоксикации (рис. 4E–F).

Одним из самых ранних критериев диагностики ХС были нервно-психические нарушения. Морфологическим эквивалентом проявлений токсико-гипоксической, дисциркуляторной энцефалопатии при ХС были гистологические изменения головного мозга — периваскулярный и перицеллюлярный отек, венозное полнокровие, периваскулярные скопления лейкоцитов, выраженные дистрофические изменения нейронов, лейкостазы, набухание и десквамация эндотелия в сосудах микроциркуляторного русла мозга (рис. 4A–B). Отек головного мозга считали одним из наиболее танатогенетически значимых осложнений ХС.

Танатогенетическое значение при ХС имели нарушения трофики миокарда, что гистологически проявлялось у всех умерших полнокровием, выраженными дистрофическими изменениями миокардиоцитов (преимущественно вакуольная дистрофия) в миокарде, в половине случаев — с фрагментацией кардиомиоцитов, пролиферацией и десквамацией эндотелия капилляров в миокарде (рис. 4D).

Непосредственной причиной смерти одного пациента из группы В + С было массивное кровотечение из острых эрозий и стрессорных язв желудочно-кишечного тракта.

Таким образом, при изначально сопоставимой тяжести состояния и одинаковом уровне прогнозируемой летальности во всех исследуемых группах, но при стартовом достоверно более низком уровне апоптоза циркулирующих Нф (табл. 1) пациенты группы А продемонстрировали достоверно более высокие шансы и риски летального исхода в связи с развитием и прогрессированием органной дисфункции и СПОН, чем пациенты группы В + С (табл. 3). Можно предположить, что в патогенезе СПОН при ХС существенную роль сыграла пролонгация жизни циркулирующих полиморфноядерных нейтрофилов вследствие стартово достоверно более низкого уровня апоптоза циркулирующих Нф в группе А (рис. 2А). Не устраняемые путем апоптоза активированные Нф, покидая сосудистое русло и устремляясь в ткани органов (рис. 4В–С, E–F), продолжали гиперпродукцию мощных протеаз, NO, АФК (рис. 2С–F), которые не только повреждали микроорганизмы, но и вызывали универсальное повреждение эндотелиоцитов (рис. 4A, D), микроциркуляторно-митохондриальный дистресс, что приводило к развитию так называемой ранней цитокин-обусловленной органной дисфункции — недостаточности с трансформацией в танатогенетически значимую полиорганную несостоятельность.

Выводы

1. Полиморфноядерные нейтрофилы, как клетки первой линии неспецифической иммунной защиты организма от микробной агрессии, играют ключевую роль в патогенезе сепсиса и полиорганных нарушений.

2. Задержка апоптоза нейтрофилов при хирургическом сепсисе способствует повреждению эндотелия и развитию митохондриально-микроциркуляторного дистресса, что приводит к трансформации сепсиса в тяжелый сепсис — сепсис с органной дисфункцией.

3. Для прогнозирования тяжести течения хирургического сепсиса может быть использовано суправитальное определение уровня апоптотических и некротически измененных циркулирующих нейтрофилов с вычислением отношения некротически измененных нейтрофилов к апоптотическим, причем за значения нормы принимают значения отношения от 3,1 до 4,3 и при значениях этого отношения более 4,50, но менее 10, прогнозируют неосложненное течение хирургического сепсиса без развития полиорганной недостаточности, а при значениях этого отношения 10 и более прогнозируют осложненное течение хирургического сепсиса с развитием полиорганной недостаточности [4], что требует проведения экстренной целенаправленной органопротективной терапии — модифицированного протокола MUST.

Список литературы

1. Нестеренко А.Н. Апоптоз нейтрофилов как прогностический критерий течения хирургического сепсиса // Біль, знеболювання і інтенсивна терапія. — 2007. — № 3 (д). — С. 109-110.
2. Нестеренко А.Н. Ксилат в инфузионной терапии клинических синдромов тяжелого хирургического сепсиса // Укр. хіміотер. журнал. — 2008. — № 1–2 (22). — С. 254-258.
3. Нестеренко А.Н. Выбор антибактериальной терапии хирургического сепсиса с учетом региональных особенностей роста резистентности его основных возбудителей // Український журнал хірургії. — 2009. — № 2. — С. 101-109.
4. Пат. UA 15271, Україна, МПК6 G 01 N 33/48. Спосіб прогнозування перебігу хірургічного сепсису / Нестеренко О.М.; заявник і патентовласник Донецький держ. мед. університет ім. М. Горького. – № u 2006 00063; заявл. 03.01.06; опубл. 15.05.2006. Бюл. № 6.
5. Стариков Ю.В. Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе: Автореф. дисс. на соискание учен. степени канд. мед. наук: спец. 03.00.04 «Биохимия» и 14.00.16 «Патологическая физиология». — Новосибирск, 2008. — 22 с.
6. Черний В.И., Нестеренко А.Н. Нарушения иммунитета при критических состояниях: особенности диагностики // Внутренняя медицина. — 2007. — № 3. — С. 25-39.
7. Castellheim A., Brekke O.-L., Espevik. T. et al. Innate Immune Responses to Danger Signals in Systemic Inflammatory Response Syndrome and Sepsis // Scandinavian Journal of Immunology. — 2009. — Vol. 69. — P. 479-491.
8. Chakravarti A., Allaeys I., Poubelle P.E. Neutrophils and immunity: is it innate or acquired ? // Med. Sci (Paris). — 2007. — Vol. 23, № 10. — P. 862-867.
9. Dellinger R.P., Levy M.M., Carlet J.M. et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008 // Intensive Care Med. — 2008. — Vol. 34, № 1. — P. 17-60.
10. Fialkow L., Filho L.F., Bozzetti M.C. et al. Neutrophil apoptosis: a marker of disease severity in sepsis and sepsisinduced acute respiratory distress syndrome // Crit. Care. — 2006. — № 6. — R155 (doi:10.1186/cc5090). Available online https://ccforum.com/content/10/6/R155.
11. Hotchkiss R.S., Osmon S.B., Chang K.C. et al. Accelerated Lymphocyte Death in Sepsis Occurs by both the Death Receptor and Mitochondrial Pathways // J. Immunol. — 2005. — Vol. 174. — P. 5110-5118.
12. Huet O., Obata R., Aubron C. et al. Plasmainduced endothelial oxidative stress is related to the severity of septic shock // Crit. Care Med. — 2007. — vol. 35. — P. 821-826.
13. Kantari C., Pederzoli-Ribeil M., Witko-Sarsat V. The role of neutrophils and monocytes in innate immunity // Contrib. Microbiol. — 2008. — Vol. 15. — P. 118-146.
14. Kempe D.S., Akel A., Lang P.A. et al. Suicidal erythrocyte death in sepsis // J. Mol. Med. — 2007. — Vol. 85, № 3. — P. 269-277.
15. Levy M.M., Marshall J.C., Fink M.P. et al. 2001 SCCM/ ESICM/ ACCP/ ATC/ SIS International Sepsis Definitions Conference // Crit. Care Med. — 2003. – Vol. 31, № 4. — P. 1250-1256.
16. Maianski N.A., Maianski A.N., Kuijpers T.W., Roos D. Apoptosis of Neutrophils // Acta Haematol. — 2004. — Vol. 111. — P. 56-66.
17. Maianski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M. et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis // Cell. Death and Differentiation. — 2004. — Vol. 11. — P. 143-153.
18. Martins P.S., Kallas E.G., Neto M.C. et al. Upregulation Of Reactive Oxygen Species Generation And Phagocytosis, And Increased Apoptosis In Human Neutrophils During Severe Sepsis And Septic Shock // SHOCK. — 2003. — Vol. 20, № 3. — P. 208-212.
19. Moerer O., Quintel M. Definition, Epidemiologie und konomische Aspekte der Sepsis bei Erwachsenen (Sepsis in adult patients – definitions, epidemiology and economic aspects) // Der Internist. — 2009. — DOI 10.1007/s00108 — 008 — 2285 — 7.
20. Picard K.M., O’Donoghue S.C., Young-Kershaw D.A., Russell K.J. Development and Implementation of a Multidisciplinary Sepsis Protocol // Critical Care Nurse. — 2006. — Vol. 26, № 3. — P. 43-54.
21. Remick D.G. Pathophysiology of Sepsis // Am. J. Pathology. — 2007. — Vol. 170, № 5. — P. 435-1444.
22. Shapiro N.I., Howell M., Talmor D. et al. Implementation and Outcomes of the Mutliple Urgent Sepsis Therapies (MUST) Protocol // Crit. Care Med. — 2006. — Vol. 34, № 4. — P. 1025-1032.
23. Shimaoka M., Park E.J. Advances in understanding sepsis // Eur. J. Аnaesthesiol. Suppl. — 2008. — Vol. 42. — P. 146-153.
24. Unsinger J., McDonough J.S., Shultz L.D. et al. Sepsisinduced human lymphocyte apoptosis and cytokine production in «humanized» mice // J. Leukoc. Biol. — 2009. — Vol. 86. — Uncorrected Version. Published on April 15, 2009 as DOI:10.1189/ jlb. 1008615. www.jleukbio.org.
25. Wesche-Soldato D.E., Lomas-Neira J.L., Perl M. et al. The role and regulation of apoptosis in sepsis // Journal of Endotoxin Research. — 2005. — Vol. 11, № 6. — Р. 375-382.
26. Wesche D.E., Lomas-Neira J.L., Perl M. et al. Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock // Journal of Leukocyte Biology. — 2005. — Vol. 78. — P. 325-337.