Реакции иммунитета их применение

Реакции иммунитета — это реакции между антигеном и антителом или между антигеном и сенсибилизированными лимфоцитами, которые происходят в живом организме и могут быть воспроизведены invitro. В силу высокой чувствительности и строгой специфичности они нашли широкое применение при диагностике инфекционных болезней.

Реакции антигена с антителом называются серологическими (от лат. serum— сыворотка) или гуморальными (от лат. humor — жидкость). Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоцитами называются клеточными.

Серологические реакции — реакции взаимодействия антигена с антителом протекают в две фазы: первая фаза — специфическая, характеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела (видимого изменения в этой фазе не происходит; вторая фаза — неспецифическая. В этой фазе образовавшийся комплекс антиген — антитело утрачивает растворимость в изотоническом растворе и выпадает в осадок, а может быть видимым визуально. При взаимодействии антител с низкодисперсными антигенами (бактерии, эритроциты) наблюдается феномен агглютинации; при взаимодействии антител с высокодисперсными антигенами (полисахаридами, белками и их комплексами) образуются преципитаты (флокуляты).

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ

В реакции агглютинации (РА) участвуют антитела (агглютинины), содержащиеся в сыворотке крови больного организма, антиген (агглютиноген) — клетки живых или убитых бактерий, возбудителей данной болезни, а неспецифическая фаза осуществляется в присутствии электролита (0,85 %-ного раствора хлорида натрия). Сущность реакции заключается во взаимодействии антитела с антигеном, в результате чего происходит вклеивание микробов с образованием хлопьев, комков, видимых невооруженных глазом. РА характеризуется высокой специфичностью и используется с 1 двоякой целью: а) для диагностики инфекционной болезни путем обнаружения в сыворотке крови больного животного антител к определенному – известному виду микроба (антигену); б) определения вида (типа) выпиленного микроба при помощи заведомо известных агглютинирующих сывороток, содержащих видо- и типоспецифические антитела (агглютинины).

Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровекапельный, кольцевая реакция с молоком, антиглобулиновый тест (реакция) Кумбса, реакция гемагглютинации и др. В ветеринарной практике РА применяется для диагностики бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, лептоспироза, листериоза и многих других болезней, а также для идентификации выделенных возбудителей.

В последние годы широко применяют реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). По своей высокой чувствительности и специфичности РНГА заняла одно из ведущих мест в серодиагностике. Сущность ее заключается в том, что белковые молекулы антигена соответствующего возбудителя предварительно адсорбируют на обработанных танином эритроцитах барана. Затем ставят реакцию путем смешения сенсибилизированных эритроцитов с сывороткой крови больных животных. При наличии в сыворотке специфических антител на данный антиген происходит агглютинация эритроцитов — реакция положительна. РНГА ставят при диагностике микоплазмоза, сальмонеллезов, вирусных инфекций.

РЕАКЦИЯ КУМБСА

Реакция Кумбса (РК, антиглобулиновый метод) позволяет выявить неполные антитела (агглютиноиды, блокирующие). Неполные антитела одновалентны, в связи с чем они тормозят образование агглютината в РА. Кумбс (1945) предложил эффективный метод выявления неполных антител. Метод основан на применении алтиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). Антиглобулиновую сыворотку получают иммунизацией кроликов сывороткой крови или глобулиновой фракцией животного того вида, у которого исследуют наличие неполных антител.

Имеется два варианта постановки реакции Кумбса: прямой и непрямой. Прямой метод заключается в том, что берут эритроциты исследуемого больного (иммунизированного) животного, которые

на поверхности содержат адсорбированные неполные антитела. При добавлении антиглобулиновой сыворотки к таким эритроцитам invitro происходит их агглютинация. Непрямой вариант реакции Кумбса основан на исследовании сыворотки крови больного животного, содержащей неполные антитела. Сыворотку смешивают с эритроцитами здорового животного для адсорбции ими неполных антител. Затем к эритроцитам добавляют антиглобулиновую сыворотку, которая вступает в реакцию с неполными антителами, в результате происходит агглютинация эритроцитов.

РК используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в бактериальном варианте, т. е. вместо эритроцитов используют бактерии бруцелл.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Для постановки реакции преципитации (РП) используют высокодисперсный антиген в виде прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. При соединении антигена (преципитиногена) с антителом (преципитином) в присутствии электролита (0,85 %-ного раствора NaCl) происходит взаимодействие с образованием видимых агрегатов (помутнение, хлопья) частиц, которые постепенно осаждаются на дно пробирки. Осадок получил название «преципитат». РП протекает в две фазы. В первой происходит соединение антигена с антителом, во второй — коагуляция (преципитация) специфического комплекса антиген — антитело в растворе электролита с образованием видимых частиц (серо-белые хлопья, помутнение). Поиск антигена в исследуемом материале проводят с заведомо известной преципитирующей сывороткой.

РП высокоспецифична и чувствительна, позволяет обнаружить антиген в разведении до 1:10 млн. Применяется для исследования кожевенного сырья на сибирскую язву, идентификации некоторых вирусов, бактерий, при установлении фальсификации мяса и др.

Антиген для реакции получают путем экстракции из микробных культур, тканей и органов павших животных, а также из кожевенного сырья. Антитела получают путем гипериммунизации животных антигенами.

Существуют различные методы постановки РП. В ветеринарной практике чаще всего применяют реакцию кольцепреципитации и диффузионной преципитации в агаровом геле.

Реакция кольцепреципитации (реакция Асколи) применяется для обнаружения сибиреязвенного антигена в животном сырье (кожи, кусочки внутренних органов, мышцы). Антиген получают путем экстрагирования в физрастворе горячим или холодным способом. Полученный антиген наслаивают тонкой стеклянной пипеткой на преципитирующую сыворотку, либо сыворотку подслаивают под антиген в узких пробирках. При положительном результате через несколько минут на границе соприкосновения антигена и антитела появляется преципитат, напоминающий серо-белое кольцо или диск.

Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП). Эта реакция считается наиболее чувствительной и эффективной при иммунологических исследованиях. В отличие от жидкой среды, где образуется одна линия (полоска) преципитации, в условиях геля.

I реагенты (антигены и антитела) диффундируют навстречу друг другу и на границе соприкосновения (встречи) образуются белые линии преципитата. Существует несколько методов постановки РП.

Метод прямой одномерной диффузии РДП заключается в том, что на столбик или пластинку агара, содержащего специфическую преципитирующую сыворотку, наслаивают антиген в физрастворе, который медленно диффундирует в агар. В результате взаимодействия образуются полоски преципитата, соответствующие реагирующим антигену — антителу.

Метод двойной (встречной) двухмерной диффузии, предложенный Оухтерлони. Реакцию ставят в чашках Петри или на предметных стеклах, залитых 1 %-нымнейтральным агаром. В застывшем агаре с помощью пробойника вырезают по трафаретке луночки размером 0,6 мм.

Обычно в центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в окружающие лунки испытуемые (экстракты) и контрольные антигены. Оба компонента диффундируют во встречном направлении в слое агарового геля. На месте встречи специфических антигена и антитела образуется преципитат серо-белого цвета в виде полосок, линий. При ‘исследовании набора антител в исследуемых сыворотках в центральную лунку вносят известный антиген, а в окружающие — соответствующие сыворотки.

В 1953 г. Окли и Фултроп предложили сравнительно простой метод постановки РДП, заключающийся в том, что каждый реагент (антиген и антитело) смешивают с агаром отдельно и поочередно вносят в пробирку. На границе слоев в пробирке при положительном результате образуется полоска преципитата.

Радиальнаяиммунодиффузия (РИД). На поверхность стекла или пластика наливают расплавленный агар, предварительно смешанный с высокоактивной антисывороткой. В застывшем агаре делают лунку (обычно до 2 мм в диаметре) и заполняют ее точным количеством испытуемого антигена. Опыт проводят во влажной камере при постоянной температуре. Антиген диффундирует из лунок радиально в агаровый гель, смешанный с антителами, в результате образуются кольца преципитации. Диаметр этих колец прямо пропорционален концентрации антигена.

РИД используют для определения содержания растворимых антигенов, иммуноглобулинов всех классов, а также различных токсинов и ферментов.

РЕАКЦИЯ ФЛОКУЛЯЦИИ

Реакцию флокуляции открыл Рамон в 1922 г. Он установил, что при смешивании антидифтерийной сыворотки и токсина (или анатоксина) в пробирке, где произошла нейтрализация токсина, появляется помутнение, затем образуются хлопья, которые оседают на дно. Этот феномен получил название реакции флокуляции. Методика опыта заключается в следующем. В ряд пробирок с постоянной дозой токсина (например, 1 мл) вносят нарастающее количество антитоксической сыворотки. Опыт ведут при 37 °С. В отдельных пробирках через некоторое время образуется опалесценция или мелкие хлопья, постепенно выпадающие в осадок при просветлении жидкости. Смесь, в которой раньше всего появилась флокуляция, соответствует нейтральной Смеси, т. е. нейтрализации всего количества взятого токсина (инициальная флокуляция). Следовательно, если известна сила токсина, которая может быть установлена с помощью сыворотки с определенным содержанием антитоксических единиц, то можно выяснить количество антитоксина и в неизвестной испытуемой сыворотке.

Количество анатоксина (например, столбнячного), дающее в смеси с 1 АЕ сыворотки инициальную флокуляцию, называют одной иммуногенной единицей (1 ИЕ). Сила (титр) антитоксической сыворотки характеризуется условно принятой антитоксической единицей (АЕ). АЕ противостолбнячной сыворотки считается наименьшее количество, нейтрализующее 1000 DLM столбнячного токсина.

Источник

Реакции иммунитета применяются для диагностики инфекционных болезней, анализа антигенной структуры микроорганизмов, суждения об эволюционных и генетических связях различных видов организмов. В основу практического применения этих реакций положен принцип тесной физико-химической связи между антигенами и антителами, специфичности их взаимодействия. На основании этого принципа по одному известному компоненту можно делать заключение о природе другого, т. е. природу неизвестного возбудителя можно определить по известным антителам и наоборот. Реакции иммунитета дают возможность судить о динамике защитных свойств организма в процессе инфекционного заболевания, степени иммунитета, возникающего в случае применения предохранительных прививок.

Рассмотрим основные принципы реакций иммунитета, имеющие наиболее важное практическое значение, реакция агглютинации Реакция агглютинации протекает в две фазы. В первой фазе происходит адсорбция агглютининов на поверхности клетки, во второй образование агрегатов (агглютината) и выделение их в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролитов. Предполагалось, что антитела только изменяют чувствительность клеток, а сам феномен осуществляется в результате воздействия электролитов. В настоящее время считается, что процесс агглютинации происходит в соответствии с теорией решетки, согласно которой агглютинат образуется вследствие того, что двухвалентные антитела, одним активным центром соединяющиеся с одной клеткой, другим с другой, образуют плотное их соединение и выпадение в осадок. В пользу этой точки зрения говорят данные, что при образовании агглютината существенное значение имеют определенные количественные соотношения антигена и антител (феномен оптимума) и задержка агглютинации при избытке или недостатке антител. Эти реакции применяются для диагностики инфекционных заболеваний, определения природы возбудителей и их атттигешгай структуры.

13. Реакции по типу агглютинации: реакция агглютинации на стекле и развернутая, реакция непрямой гемагглютинации. Механизмы реакций, компоненты. Применение.

Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора

натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция

агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) —крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя.

Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии

Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 1369 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов

Читайте также:

Рекомендуемый контект:

Поиск на сайте:

Источник

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний

Становление иммунологических методов распознавания инфекционных заболеваний пришлось на конец ХIХ-начало XX в. Поскольку взаимодействия иммунной системы и Аг изучали с применением AT сыворотки крови, эти методы получили назвали серологические реакции. Основная идея этих методов — установить феномен ответа организма на чужеродный Аг. Выявление AT к инфекционному агенту даёт возможность не только выявить выраженную текущую инфекцию, но и установить факт первичного инфицирования. Серологические реакции активно применяют при проведении полного объёма диагностических исследований. Увеличение титров AT — зачастую единственный дифференциально-диагностический признак, указывающий на инфекционное заболевание. Выявление AT особенно актуально при неудачных попытках выделить возбудитель инфекции. Однако классические реакции выявления микробных Аг и AT к ним в значительной степени потеряли своё значение в экспресс-диагностике бактериальных инфекций. С одной стороны, такие реакции чувствительны к значимым титрам AT, появляющимся к концу первой недели болезни, что не позволяет поставить диагноз на начальных этапах развития патологического процесса. С другой стороны — при выявлении микробных Аг в серологических реакциях с помощью коммерческих AT необходимо адекватное количество Аг. Избыток или недостаток Аг блокирует достаточное для прочтения реакции образование иммунных комплексов. Проявление этого — «зоны задержки» (феномен прозоны) — отсутствие агглютинации или преципитации при малых или больших разведениях сыворотки крови (рис. 10-13). Тем не менее серологические реакции остаются важным инструментом диагностики заболеваний и идентификации возбудителей. Современный арсенал методов лабораторного распознавания возбудителей составляют десятки иммунодиагностических тестов. Их объединяет общее свойство — все тесты сравнительно редко дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Серологические реакции применяют для двух целей:

1. По известному АГ определяют в исследуемой сыворотке титр специфических к данному АГ антител. Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое еще дает положительную реакцию с соответствующим АГ.

2. С помощью известного АТ, т.е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического антигена или осуществляют серологическую идентификацию выделенной чистой культуры возбудителя.

Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:

1. Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в растворе электролита: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные

модификации.

2. Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их модификации.

3. Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: реакции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции торможения гемагглютинации.

4. Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие.

5. Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.

Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации (РА) позволяет выявить корпускулярные Аг, точнее Аг, локализованные на поверхности сравнительно крупных частиц (микроорганизмы, клетки различного происхождения). Механизм РА описывает «теория решётки», согласно которой двухвалентное AT взаимодействует одним активным центром с детерминантой одной молекулы Аг, а другим — с детерминантой второй молекулы Аг (рис. 10-13). Рис. 10-13. Схема реакции агглютинации. А — отрицательный результат обусловлен отсутствием AT, специфичных к Аг. Б — положительный результат с образованием аггпютината наблюдают при наличии AT, специфичных к определяемому Аг; визуализация аггпютината возможна при образовании «решётки». В—ложноотрицательный результат возможен при развитии феномена прозоны, когда молекул AT недостаточно для образования «решётки» (1) или имеется избыток AT, также препятствующий её образованию (2). В результате подобного взаимодействия образуется агглютинат. Его формирование невозможно при дефиците или избытке AT. Реакция агглютинации проявляется склеиванием корпускулярных Аг под воздействием AT (агглютининов) и реализуется в изотоническом растворе электролита, например 0,9% раствора NaCl. В реакции агглютинации также можно определять и содержание AT в сыворотке крови больных, например, брюшным тифом (реакция Видаля) или бруцеллёзом (реакция Райта).

Развернутая реакция агглютинации ( РА ).Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации ( РА ). Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум — взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови. Разновидности реакции агглютинации ( РА ) для выявления AT — кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хаддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).

Ориентировочная реакция агглютинации ( РА ) Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки. Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки. О-Аг. Соматические О-Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты. Н-Аг. Н-Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками). Vi-Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60-62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi-антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.

Реакции прямой гемагглютинации Простейшая из подобных реакций — агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг — естественные компоненты эритроцитов. Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов из них.

117. Реакции иммунитета и их практическое применение при бактериальных инфекциях.

Серологические реакции применяют для двух целей:

Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:

модификации.

4. Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие.

5. Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.

Источник